細(xì)菌檢驗中菌種的保存及保管

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1、細(xì)菌檢驗中菌種的保存及保管(哈爾濱市南崗區(qū)疾病預(yù)防控制中心微牛物檢驗科黑龍江哈爾濱150001)【摘要】大多數(shù)細(xì)菌都可用人工方法培養(yǎng)，握細(xì)菌培養(yǎng)的基木技術(shù)，如無菌技術(shù)、各種細(xì)菌的營養(yǎng)要求和適宜的培養(yǎng)方法及保存、保管等。菌種的保存，特別是標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存是細(xì)菌學(xué)檢驗，教學(xué)科研機構(gòu)及有關(guān)牛產(chǎn)單位的重要工作之一。在保存菌種的過程中，除了必須保證菌株的存活外，還應(yīng)要求在保存過程中，保持其固有的各種牛物學(xué)性狀及抗原特性等?！娟P(guān)鍵詞】細(xì)菌檢驗；細(xì)菌培養(yǎng)；保存及保管【中圖分類號】R37【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A【文章編號】1007-8231(2016)13-021

2、9-02細(xì)菌培養(yǎng)是感染性疾病病原學(xué)診斷的重要環(huán)節(jié)，并有利于細(xì)菌感染的治療和預(yù)防。也是醫(yī)院感染和流行病學(xué)調(diào)查的手段。菌種的保存，特別是標(biāo)準(zhǔn)菌株的保存是細(xì)菌學(xué)檢驗，教學(xué)科研機構(gòu)及有關(guān)牛產(chǎn)單位的重要工作之一。細(xì)菌實驗室，一般應(yīng)保存一套按規(guī)定允許保存的標(biāo)準(zhǔn)菌種和菌株，保存的種類視工作需要而定。1.菌種的保存為此必須注意以下問題：①控制傳代次數(shù)：菌種傳代次數(shù)越多，其突變的幾率也就會越高。②用典型菌落傳代：為防止盲目傳代，每次傳種，均應(yīng)做劃線分離，選出具有典型性狀的菌落進(jìn)行傳代，用于保存。③通過易感動物恢復(fù)固有特性：對于已變異的病原菌，可采用接種易感

3、動物的方式，將具有毒力的細(xì)菌重新選擇出來，同時還可使一些表型變異的細(xì)菌恢復(fù)原有特性。菌種的保存方法有以下幾種方法：1.1固體培養(yǎng)基保存法此為最簡單的保存方法，但最大的不足是較易發(fā)牛變異。為了延長菌種的保存時間，接種斜面時，僅由斜面底部劃一直線即可。①普通瓊脂斜面保存法：適合于對營養(yǎng)要求不高細(xì)菌的保存。接種后，35°C18?24h培養(yǎng)后，移于4°C的冰箱中，可保存一個月，每月傳代一次。為防于涸，在斜面底部可放少許無糖肉湯（但變形桿菌“0X”及傷寒沙門菌除外）。②血瓊脂斜面保存法：適合于保存對營養(yǎng)要求高的細(xì)菌，鏈球菌應(yīng)半個月傳代一次，肺炎鏈球

4、菌等新分離的菌株應(yīng)2?4d傳代一次。③雞蛋斜面保存法：適合保存Vi抗原的沙門菌屬細(xì)菌及含表面抗原的細(xì)菌，一般可保存一個月［1］。1.2半固體穿刺保存法適合于腸道桿菌及葡萄球菌等一般細(xì)菌的保存。當(dāng)細(xì)菌生長良好后，在其表面加一層lcm高無菌的液體石蠟，在4°C冰箱中，一般細(xì)菌可保存數(shù)月。凡需特殊培養(yǎng)的細(xì)菌，則分別選用各自適宜的培養(yǎng)基進(jìn)行保存。1.3干燥保存法干燥保存法是將細(xì)菌體內(nèi)的水分蒸發(fā)掉，使細(xì)菌處于代謝停滯的狀態(tài)，從而達(dá)到長期保存的目的。干燥保存法有多種，如砂土干燥保存法，明膠保存等，其中最好的方法是冷凍真空干燥保存法，此法是將生長旺盛的

5、細(xì)菌在凍結(jié)狀態(tài)下真空干燥，使細(xì)菌保持休眠狀態(tài)［2］。該法可免去細(xì)菌的頻繁傳代，也可防止在傳代過程中可能造成的污染、變異或死亡。保存期一般在3?5年，有的可達(dá)10年以上，是目前最有效的保存方法。①準(zhǔn)備安甑管：選用中性硬質(zhì)玻璃安甑管，用10%HCI浸泡8?10h,再用自來水沖洗多次，最后用蒸徭水洗1?2次，烘干。管口塞上棉花，121°C滅菌30mino管壁貼印有菌種名稱及接種日期的標(biāo)簽，并用固體石蠟熔化后薄薄地封一層，以防標(biāo)簽字模糊。②制備脫脂牛奶：將新鮮牛奶煮沸，除去表面油脂，用脫脂棉過濾，離心3000r/min15min,再除去上層油脂,

6、分裝，115°C滅菌30min,并作無菌試驗。③制備菌液：吸取3ml無菌牛奶加入已培養(yǎng)16?18h的斜面菌種管，用接種環(huán)輕輕攪動菌苔，搓動試管，制成均勻的細(xì)胞懸液。④分裝菌液：用無菌的長頸滴管將菌液分裝于安咅瓦管底部，每管裝0.2ml。①預(yù)凍：將裝有菌液的安甑置一40°C低溫冰箱酒精槽內(nèi)快速冷凍。安甑快速冷凍只需4?5min,然后將安甑放于干燥器內(nèi)，置?20°C低溫冰箱或裝有維持冷凍劑⑴3的鹽冰混合劑）的槽內(nèi)，可保持6?18h。②真空干燥：預(yù)凍完成后，開動真空泵抽氣。使氣壓降至133.3kPa以下，維持凍結(jié)劑可于4h后移去。繼續(xù)于室溫中抽

7、氣，直至變色硅膠由粉紅色變?yōu)槿{(lán)色，再繼續(xù)抽氣，達(dá)到完全干燥。一般菌種干燥需6?8h。③封管：待菌種完全干燥后，立即從干燥缸內(nèi)取出安甑，置于抽氣管上抽成真空，約需3?lOmino用高頻真空檢測儀檢查，若安甑頸部呈現(xiàn)淡紫色熒光，即可邊抽氣邊封口。置4°C冰箱保存。無干燥機的實驗室，可自行安裝簡易冷凍干燥系統(tǒng)。安裝吋，所有的連接處必須嚴(yán)縫，所用管道以粗為好，并盡量縮短真空系統(tǒng)線路，以便通暢，安裝完畢，應(yīng)檢查有無漏氣，以其壓力能低到0.2mmHg為準(zhǔn)。④復(fù)蘇培養(yǎng)：安甑先用碘酒、酒精消毒，置火焰上烤熱，滴加無菌蒸憾水,使安甑尖端炸裂。然后用數(shù)層紗

8、布包住折斷。用無菌吸管取0.2ml肉湯注入安甑，使其全部溶解，移種適宜培養(yǎng)基。1.4液氮超低溫保存將菌種保存在J50?-196%超低溫的液氮中，在該溫度下，細(xì)菌等微生物的代謝處于停滯狀態(tài)，因此