電穿孔精子介導的華貴櫛孔扇貝轉(zhuǎn)基因初步研究

《電穿孔精子介導的華貴櫛孔扇貝轉(zhuǎn)基因初步研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學術(shù)論文-天天文庫。

1、碩士學位論文題目：電穿孔精子介導的華貴櫛孔扇貝轉(zhuǎn)基因初步研究英文題目：Preliminarystudyonelectroporation-aidedsperm-mediatedgenetransferinnoblescallopChlamysnobilis姓名張云學號11508053所在學院理學院導師姓名鄭懷平專業(yè)海洋生物學學入學日期2015年9月答辯日期2018年6月汕頭大學碩士學位論文汕頭大學碩士學位論文電穿孔精子介導的華貴櫛孔扇貝轉(zhuǎn)基因初步研究Preliminarystudyonelectroporation-aidedsperm-mediat

2、edgenetransferinnoblescallopChlamysnobilis學位申請人：張云導師：鄭懷平（教授，博導）專業(yè)：海洋生物學答辯委員會主席：鄧岳文教授答辯委員會委員：劉賢德教授李升康教授馬洪雨教授王樹啟副教授汕頭大學海洋生物研究所中國，汕頭，515063汕頭大學碩士學位論文學位論文原創(chuàng)性聲明本論文是我個人在導師指導下進行的工作研究及取得的研究成果。論文中除了特別加以標注和致謝的地方外，不包含其他人或其它機構(gòu)已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果。對本文的研究做出貢獻的個人和集體，均已在論文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律責任由本人承

3、擔。作者簽名：日期：年月日學位論文使用授權(quán)聲明本人授權(quán)汕頭大學保存本學位論文的電子和紙質(zhì)文檔，允許論文被查閱和借閱；學?？蓪⒈緦W位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或其它復制手段保存和匯編論文；學?？梢韵驀矣嘘P(guān)部門或機構(gòu)送交論文并授權(quán)其保存、借閱或上網(wǎng)公布本學位論文的全部或部分內(nèi)容。對于保密的論文，按照保密的有關(guān)規(guī)定和程序處理。作者簽名：導師簽名：日期：年月日日期：年月日汕頭大學碩士學位論文汕頭大學碩士學位論文摘要華貴櫛孔扇貝（Chlamysnobilis）是我國南方海區(qū)重要的養(yǎng)殖貝類。華貴櫛孔扇貝“南澳金貝”是本課題組

4、培育的富含類胡蘿卜素的新品種，其貝殼、外套膜、閉殼肌均為金黃色，而褐色品系是類胡蘿卜素含量低的新品系，其外套膜、閉殼肌均為白色。SRB-like-3基因是已驗證的與類胡蘿卜素富集相關(guān)的關(guān)鍵基因，其只在“南澳金貝”中表達。本研究首先構(gòu)建了含SRB-like-3基因的重組質(zhì)粒，將此質(zhì)粒以電穿孔-精子介導的轉(zhuǎn)基因（SMGT）方法導入褐色品系扇貝精子中，研究分析電穿孔對其精子生理特性的影響及轉(zhuǎn)染效果，探討華貴櫛孔扇貝電穿孔-精子介導的轉(zhuǎn)基因技術(shù)的可行性。主要研究結(jié)果如下：1）最佳電脈沖參數(shù)的確定：經(jīng)過三個不同水平篩選，初步確定了幾組脈沖電壓與脈沖時間的參數(shù)組

5、合，分別為50V，4ms、100V，1ms、150V，800μs、200V，700μs、250V，400μs、300V，200μs、350V，200μs、400V，200μs、450V，100μs、500V，100μs。并從中選取100V、200V、250V、300V、400V、500V對應(yīng)的脈沖組合作為后續(xù)實驗的條件。在這六組脈沖參數(shù)組合下分別檢測了精子成活率、活動率、受精率和孵化率。結(jié)果顯示，脈沖參數(shù)為500V，100μs時，精子成活率和快旋精子率與對照組均有極顯著性差異（P＜0.01），精子在各電擊條件下的總活動率與對照組均有顯著性差異（P＜0

6、.05）。電擊后的精子與卵子受精，受精率均達到80%以上，孵化率均在90%以上。PCR結(jié)果顯示，DNaseⅠ處理前后，電擊組與孵育組均檢測到陽性條帶。2）外源DNA濃度對電穿孔效果的影響：無論是環(huán)狀質(zhì)粒還是線性質(zhì)粒，在一定范圍內(nèi)，質(zhì)粒濃度越大，基因?qū)胄Ч胶?。本實驗中，質(zhì)粒濃度為15μg/ml的導入效果最佳。3）外源DNA及孵育對精子的影響：外源DNA的存在并不會對精子的活動率、受精率、孵化率產(chǎn)生影響；孵育會降低精子活動率，但受精率、孵化率則不受影響。4）外源DNA在擔輪幼蟲和D-型幼蟲中的導入及表達效率：PCR結(jié)果顯示，在擔輪幼蟲中能檢測到線性質(zhì)

7、粒組的外源DNA的信號，在D-型幼蟲中能檢測到環(huán)狀質(zhì)粒組的外源DNA的信號。qPCR結(jié)果顯示，環(huán)狀質(zhì)粒組和線性質(zhì)粒組的SRB-like-3及EGFP基因在擔輪幼蟲和D-型幼蟲中均有顯著性表達，且擔輪幼蟲I汕頭大學碩士學位論文中，線性質(zhì)粒組SRB-like-3及EGFP基因的表達顯著高于環(huán)狀質(zhì)粒組。以上研究結(jié)果表明，電穿孔華貴櫛孔扇貝精子的最佳電擊條件為400V，200μs。質(zhì)粒通過直接孵育或電穿孔的方法均能進入華貴櫛孔扇貝精子，電穿孔確實能輔助精子吸收外源基因，提高轉(zhuǎn)基因的效率。線性質(zhì)粒的導入效果比環(huán)狀質(zhì)粒好。外源DNA通過電穿孔精子的方法能成功導入

8、華貴櫛孔扇貝胚胎中并表達。電穿孔精子介導的轉(zhuǎn)基因方法在華貴櫛扇貝中是可行的。關(guān)鍵詞：華貴櫛孔扇貝（Chlam