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《皮質(zhì)發(fā)育不良大鼠差異蛋白篩選和其致癇作用探析》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、皮質(zhì)發(fā)育不良大鼠差異蛋白篩選和其致癇作用探析【摘要】目的尋找皮質(zhì)發(fā)育不良大鼠腦組織(皮質(zhì)和海馬)與正常對(duì)照組織在不同發(fā)育階段的差異表達(dá)蛋白質(zhì),探討這些蛋白質(zhì)在皮質(zhì)發(fā)育不良所致癲癇發(fā)生機(jī)制中的作用。方法妊娠晚期(孕17d)Sprague-Dawley大鼠腹腔注射卡莫司汀(15mg/kg)誘導(dǎo)仔鼠皮質(zhì)發(fā)育不良。提取新生期(出生后7d,記作P7)及成年仔鼠(P60)新皮質(zhì)及海馬組織蛋白,運(yùn)用雙向凝膠電泳技術(shù)構(gòu)建卡莫司汀誘導(dǎo)皮質(zhì)發(fā)育不良鼠和正常鼠皮質(zhì)及海馬組織在新生期及成年期的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,通過(guò)比對(duì)分析篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)。應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)對(duì)差異最為顯著
2、的部分蛋白進(jìn)行鑒定。結(jié)果在模型組和對(duì)照組之間共篩選出57個(gè)差異表達(dá)蛋白質(zhì)斑點(diǎn)(P皮質(zhì)發(fā)育不良(Corticaldysplasia,CD)是難治性癲癇的重要病因之一,但CD的致癇機(jī)制仍有待進(jìn)一步闡釋。比較蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)是一種新型的髙通量差異蛋白篩查技術(shù),正在逐步運(yùn)用到神經(jīng)病學(xué)研究的各個(gè)領(lǐng)域。我們采用卡莫司汀誘導(dǎo)的CD大鼠模型,運(yùn)用雙向電泳技術(shù)對(duì)比分析CD大鼠和正常大鼠皮質(zhì)及海馬組織在不同發(fā)育時(shí)期(新生期和成年期)的蛋白質(zhì)表達(dá)譜,篩選出差異表達(dá)的蛋白質(zhì)斑點(diǎn)并應(yīng)用MALDI-TOF-MS技術(shù)平臺(tái)進(jìn)行鑒定,以期進(jìn)一步探討皮質(zhì)發(fā)育不良癲癇易感性的發(fā)生機(jī)制并發(fā)現(xiàn)新的治療靶點(diǎn)。1材料與
3、方法1.1動(dòng)物模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組健康懷孕Sprague-Dawley大鼠5只由浙江中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,孕]7d(Embryonicday17,E17),體質(zhì)量270?320go于E17隨機(jī)選取3只孕鼠腹腔內(nèi)注射卡莫司汀(天津金耀制藥廠),給藥劑量為15mg/kg,E22仔鼠出生,所產(chǎn)雄性仔鼠存活11只歸入模型組;余下2只孕鼠在同一天腹腔內(nèi)注射同等劑量生理鹽水,所產(chǎn)雄性仔鼠存活16只入對(duì)照組。仔鼠出生當(dāng)天記作P0,到P21與母鼠分開(kāi)飼養(yǎng)。P7隨機(jī)(隨機(jī)數(shù)字法)選取模型組和對(duì)照組仔鼠各3只,行病理切片對(duì)照檢查驗(yàn)證制模成功。1.2蛋白質(zhì)樣品的制備與雙向凝膠電泳在P7和
4、P60分別隨機(jī)(隨機(jī)數(shù)字法)選取模型鼠和對(duì)照鼠各3只,留取前額部分新皮質(zhì)并分離海馬組織[1],所得標(biāo)本液氮中速凍后-80工保存。取大約300mg樣本,PBS清洗后切碎成1mm3見(jiàn)方的小塊,轉(zhuǎn)移至勻漿器中,加入2D裂解液(9.5mol/L尿素,65mmol/LDTT,4%CHAPS,0.2%IPG緩沖液,按1:50加入蛋白酶抑制劑約1mL,均來(lái)自美國(guó)sigma公司),勻漿20次,全過(guò)程在冰上完成。將勻漿液轉(zhuǎn)入離心管中,超聲破碎細(xì)胞(80W,5次,每次10s,間隔15s,冰上完成)。12000g離心45min,取上清液蛋白定量后-80£低溫保存。雙向電泳:上樣100ug,IE
5、F為pH3?10非線性膠條(瑞典Amersham公司),電泳在EttanIPGphorIsoelectrieFocusingSystem和HoferSE600(美國(guó)GEAmersham公司)中進(jìn)行(電泳條件:30V12h,500V1h,1000V1h,8000V8h,500V4h),SDS-PAGE為12.5%的膠,先15mA/膠30m,然后換30mA/膠至澳酚藍(lán)離膠下沿0.5cm)。每個(gè)樣品常規(guī)進(jìn)行3次雙向電泳,銀染后經(jīng)UMaxPowerlook2110XL(美國(guó)GEAmersham公司)掃描,獲得圖譜。采用ImageMaster2D軟件對(duì)圖像進(jìn)行背景消減、蛋白質(zhì)點(diǎn)檢測(cè)
6、和校正,獲取蛋白質(zhì)點(diǎn)的位置坐標(biāo)和表達(dá)量等分析。1.3質(zhì)譜掃描與數(shù)據(jù)庫(kù)搜索選取并切下差異點(diǎn)(表達(dá)量比>1.8),做膠內(nèi)酶解,每個(gè)膠粒切碎后放入離心管中,每管加入30?50UL30mmol/LK3Fe(CN)6:100mmol/LNa2S203=l:1(體積比)脫色,凍干后,加入5PL2?5?10.0ng/PL測(cè)序級(jí)Trypsin(Promega)溶液,37£反應(yīng)過(guò)夜,20h左右;吸出酶解液,轉(zhuǎn)移至新管中,原管加入1001L60%ACN/0.1%TFA,超聲15min,合并前次溶液,凍干;若有鹽,則用Ziptip(美國(guó)Millipore公司)進(jìn)行脫鹽。樣品與5mg/mLHCC
7、A基質(zhì)1:1混合后,用4800串聯(lián)飛行時(shí)間質(zhì)譜儀(美國(guó)AppliedBiosystems公司)進(jìn)行質(zhì)譜分析,激光源為355nm波長(zhǎng)的Nd:YAG激光器,加速電壓為2kV,采用正離子模式和自動(dòng)獲取數(shù)據(jù)的模式采集數(shù)據(jù),PMF質(zhì)量掃描范圍為800?4000U,選擇信噪比大于50的母離子進(jìn)行二級(jí)質(zhì)譜(MS/MS)分析,每個(gè)樣品點(diǎn)上選擇8個(gè)母離子,二級(jí)MS/MS激光激發(fā)2500次,碰撞能量2kV,CID關(guān)閉。質(zhì)譜結(jié)果查NCBI,IPI和EST庫(kù)。2結(jié)果2.1病理驗(yàn)證結(jié)果CD組仔鼠P7、P14大腦切片尼氏染色后鏡下觀察見(jiàn):皮質(zhì)變薄,皮層紊