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《大菱鲆免疫球蛋白d重鏈基因的克隆與表達研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號密級UDC研究生學(xué)位論文大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆與表達研究研究生姓名陳孔茂指導(dǎo)教師姓名戰(zhàn)文斌教授申請學(xué)位級別碩士專業(yè)名稱水產(chǎn)養(yǎng)殖論文答辯日期2013年5月學(xué)位授予日期2013年6月中國海洋大學(xué)謹以此論文獻給所有關(guān)心、支持和幫助過我的親人、師長和朋友！——陳孔茂大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆與表達研究學(xué)位論文答辯日期：2013年5月指導(dǎo)教師簽字：答辯委員會成員簽字：獨創(chuàng)聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人
2、已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含未獲得其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日---------------------------------------------------------------------學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)學(xué)校可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編
3、入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同時授權(quán)中國科學(xué)技術(shù)信息研究所將本學(xué)位論文收錄到《中國學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫》，并通過網(wǎng)絡(luò)向社會公眾提供信息服務(wù)。（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書）學(xué)位論文作者簽名：導(dǎo)師簽字：簽字日期：年月日簽字日期：年月日大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆與表達研究摘要本論文克隆了大菱鲆mIgD基因cDNA全序列，序列特性分析顯示其含有免疫球蛋白家族所有的經(jīng)典結(jié)構(gòu)域。RT-PCR分析該基因在不同組織內(nèi)的差異表達情況，實時熒光定量PCR檢測鰻弧菌刺激后前腎中該基因的
4、時空差異表達情況，推測魚類mIgD在免疫信號傳導(dǎo)及體液免疫防御中均可能起著重要作用。在序列分析的基礎(chǔ)上對其進行分段表達，構(gòu)建mIgD的δ區(qū)重組表達載體，并制備了其多克隆抗體。利用其與大菱鲆外周血白細胞間接免疫熒光實驗，結(jié)果顯示兩者發(fā)生了特異性結(jié)合，說明了外周血白細胞的細胞膜上存在膜結(jié)合型mIgD。本論文主要包括以下三部分：1大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的克隆設(shè)計簡并引物擴增大菱鲆免疫球蛋白D重鏈基因的中間保守序列，通過RACE技術(shù)獲得mIgDcDNA序列，序列全長3357bp，含一個2997bp的開放閱讀框，編碼999個氨基
5、酸，基因結(jié)構(gòu)為VDJ-μ1-δ1-δ2-δ3-δ4-δ5-δ6-δ7-TM。重鏈恒定區(qū)δ1~δ7氨基酸序列同源比對結(jié)果顯示其與庸鰈（78%）、鱖魚（71%）、牙鲆（68%）具有較高的同源性，多序列比對結(jié)果顯示大菱鲆mIgD的每個δ恒定區(qū)內(nèi)均存在色氨酸與半胱氨酸保守位點。利用鄰位相連法構(gòu)建硬骨魚類免疫球蛋白系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果顯示不同魚類IgD聚為一大支，大菱鲆mIgD與庸鰈及牙鲆聚為一支。2大菱鲆mIgD重鏈基因的表達分析利用RT-PCR分析了大菱鲆mIgD重鏈基因的組織差異表達，結(jié)果顯示其在外周血白細胞、脾臟、前腎及中腎組織
6、中具有較高的表達。將大菱鲆腹腔注射福爾馬林滅活鰻弧菌后，實時熒光定量PCR檢測了其前腎組織中mIgD重鏈基因應(yīng)答表達量，結(jié)果顯示mIgD重鏈基因在注射鰻弧菌后呈現(xiàn)顯著下調(diào)趨勢，在注射后8h時降至最低值，其相對表達量約為對照組的1/28左右，然后呈逐漸回復(fù)上調(diào)趨勢，在免疫后48h時免疫組mIgD相對表達量與對照組無顯著差異水平。3大菱鲆mIgDδ恒定區(qū)基因的重組表達及其多抗的制備構(gòu)建了mIgDδ恒定區(qū)融合表達載體pET32a-δ-mIgD，轉(zhuǎn)入大腸桿菌后成功表達，獲得分子量大小為99.5kDa的重組蛋白。另外制備了鼠抗大菱鲆
7、mIgD抗血清，ELISA實驗結(jié)果顯示，pET32a-IgDδ恒定區(qū)重組表達蛋白與鼠抗大菱鲆mIgD抗血清具有結(jié)合活性。利用該多抗通過間接免疫熒光發(fā)現(xiàn)該抗體能與大菱鲆外周血白細胞發(fā)生特異性結(jié)合，結(jié)果說明了外周血白細胞的細胞膜上存在膜結(jié)合型IgD。關(guān)鍵詞：大菱鲆；免疫球蛋白D；基因克?。粺晒舛縋CR；免疫熒光。MolecularcloningandexpressionanalysisofimmunoglobulinDheavychaininScophthalmusmaximusAbstractInthispaper,ful
8、llengthcDNAsequenceofmIgDwasclonedfromthespleenofScophthalmusmaximus,Sequenceanalysisshowedthatitcontainedtheclassicdomainoftheimmunoglobulinfamily.RT-P
