基于代謝途徑研究多殺菌素高產(chǎn)菌株選育

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1、基于代謝途徑研究多殺菌素高產(chǎn)菌株選育摘要：通過對刺糖多葩菌(Saccharopolysporaspinosa)多殺菌素代謝合成途徑的分析，提出了一種代謝控制育種策略和提高誘變篩選效率的方法。以刺糖多鞄菌QYLZ88912菌株為出發(fā)菌株，選擇不同照射時(shí)間分別對其進(jìn)行紫外線照射處理，然后用含有不同抗性物質(zhì)的搖瓶對誘變菌進(jìn)行初篩，最終篩選出了1株高產(chǎn)多殺菌素的多抗性菌株SG+St+Er+-088o該菌株同時(shí)具有磺胺肌、鏈霉素和紅霉素抗性，搖瓶發(fā)酵試驗(yàn)表明，發(fā)酵7d多殺菌素濃度可以達(dá)到1132.60mg/L,較出發(fā)菌株提髙了85.4%,經(jīng)傳代試驗(yàn)證明此菌株高產(chǎn)遺傳特性穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：代謝途徑；代謝控

2、制育種；多殺菌素；菌落形中圖分類號：Q819；Q815文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A文章編號:0439-8114(2013)10-2309-06當(dāng)前中國農(nóng)藥的應(yīng)用可以簡單地總結(jié)為農(nóng)藥品種多、質(zhì)量低、用量大、效率低、農(nóng)產(chǎn)品中殘留量高，對環(huán)境污染嚴(yán)重[1],因此開發(fā)高效綠色的新型農(nóng)藥顯得尤為重要。多殺菌素(Spinosad)又稱刺糖菌素，是由刺糖多砲菌(Saccharopolysporaspinosa)通過有氧發(fā)酵聚酮合成途徑合成的大環(huán)內(nèi)酯類抗生素，兼有化學(xué)農(nóng)藥的速效性和生物農(nóng)藥的安全性，不會(huì)對環(huán)境產(chǎn)生污染，對魚、畜、禽安全系數(shù)高。多殺菌素作為一種綠色生物農(nóng)藥，其具有殺蟲譜廣、作用方式獨(dú)特、殺蟲活性高、半衰期

3、短、殘留低、無抗藥性、對人畜無害、環(huán)境污染少等優(yōu)點(diǎn)[2],是一種具有觸殺及胃毒毒性的新型微生物源殺蟲劑，于1999年獲得美國“總統(tǒng)綠色化學(xué)品挑戰(zhàn)獎(jiǎng)”[3],在農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)中具有廣闊的應(yīng)用前景，該類產(chǎn)品的開發(fā)也具有良好的經(jīng)濟(jì)效益和社會(huì)效益。刺糖多胞菌屬于糖多胞菌屬(Saccharopolyspora),是迄今發(fā)現(xiàn)的惟一可以通過好氧發(fā)酵產(chǎn)生多殺菌素的菌株。目前國外多殺菌素的研究領(lǐng)域已延伸到開發(fā)殺蟲活性更高、生物安全性更好的衍生物上。國內(nèi)對發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素的研究起步晩，最近幾年也取得了很大的進(jìn)展，但較國外研究水平還有很大的差距[4]。國內(nèi)報(bào)道多殺菌素高產(chǎn)菌株較高生產(chǎn)水平為800?1260mg/L[

4、5,6],而國外早在10多年前就實(shí)現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。多殺菌素的制備方法主要為微生物液體發(fā)酵合成，生物合成多殺菌素具有突出的優(yōu)點(diǎn)，工藝條件較易控制、產(chǎn)品質(zhì)量穩(wěn)定、提取較為方便，但微生物液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)多殺菌素產(chǎn)量很低，主要問題是缺乏高產(chǎn)菌株，以致影響了該物質(zhì)的應(yīng)用。因此篩選高產(chǎn)菌株，為中國農(nóng)藥領(lǐng)域開辟新型綠色產(chǎn)品，對農(nóng)牧業(yè)生產(chǎn)具有重要的意義。試驗(yàn)運(yùn)用理性篩選思路和高效誘變方法，篩得高產(chǎn)菌株，并對其進(jìn)行生物化學(xué)和遺傳學(xué)分析。1材料與方法1.1供試菌種刺糖多砲菌QYLZ88912菌株，由天津北洋百川生物技術(shù)有限公司保藏。1.2培養(yǎng)基保藏分離培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L,葡萄糖5g/L,酵母提取物3g/

5、L,玉米漿10g/L,MgS04?7H202g/L,瓊脂20g/L,pH6.5?6.7,121°C高壓蒸汽滅菌20mino種子培養(yǎng)基：可溶性淀粉20g/L,葡萄糖5g/L,酵母提取物3g/L,玉米漿10g/L,MgS04?7H202g/L,pH6.5?6.7,121°C高壓蒸汽滅菌20min。發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖40g/L,可溶性淀粉30g/L,玉米浸液15g/L,棉子濃縮粉20g/L,酵母粉20g/L,碳酸鈣3g/L,pH7.0?7.2,121°C高壓蒸汽滅菌30min。1.3主要試劑試驗(yàn)所用主要試劑情況見表1。1.4菌株QYLZ88912對所用抗性物質(zhì)的耐受上限試驗(yàn)將出發(fā)菌株的砲子懸浮液

6、涂布于含有不同抗性物質(zhì)、不同設(shè)計(jì)水平的平板，每個(gè)處理做3個(gè)平行，在相對濕度70%?80%、29°C的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)7?9d,觀察抗性平板的菌株生長情況，確定出發(fā)菌株對所用抗性物質(zhì)的致死（耐受）上限。1.5菌株的誘變處理1.5.1胞子懸浮液的制備選擇生長良好的多殺菌素出發(fā)菌株QYLZ88912斜面菌種，用無菌生理鹽水將其胞子洗下，轉(zhuǎn)入裝有玻璃珠的無菌三角瓶中振蕩30min,使鞄子充分分散，用脫脂棉過濾砲子懸浮液，并調(diào)節(jié)胞子懸浮液濃度為106?107個(gè)/mL,備用。1.5.2致死率測定取處理好的胞子懸浮液于30W紫外燈下30cm處分別照射不同的時(shí)間進(jìn)行誘變處理，將誘變后的胞子懸浮液梯度稀釋涂于保

7、藏分離培養(yǎng)基平板，于29°C避光培養(yǎng)7?9d,計(jì)算致死率。1.6分析方法1.6.1色譜分析高效液相色譜儀Agilenttechnologies1200series；色譜柱AgilentNucleosil100-5C18,5um,150mmX4.6mm；流動(dòng)相甲醇-乙睛-2%乙酸鐵水溶液，甲醇：乙睛:2%乙酸鞍水溶液（體積比）為45：45：10；流速1.5mL/min；進(jìn)樣量10nL；檢測波長250nm；柱溫35°C；檢測