檢測致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒抗原或抗體的elisa方法的建立

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1、檢測致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒抗原或抗體的ELISA方法的建立EstablishmentofELISAsfordetectingantibodyorantigenofduckreovirus(DRV)thatcausingduckegglayingdrop、、／一?一一研究生：孫陳莉?qū)I(yè)：預防獸醫(yī)學導師：吳艷濤教授揚州大學獸醫(yī)學院2013年6月孫陳莉：檢測致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒抗原或抗體的ELISA方法的建立檢測致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒抗原或抗體的ELIsA方法的建立I愀黜研究生：孫陳莉‘一一一一一一導師：吳艷濤教授摘要呼腸

2、孤病毒感染可引起鴨的以頭頸腫脹、眼結(jié)膜充血(出血)、全身皮膚廣泛出血等為主要特征的傳染病，被國內(nèi)外視為危害養(yǎng)鴨業(yè)健康發(fā)展的重要疫病之一。2010年起，我國南方地區(qū)蛋鴨中陸續(xù)發(fā)生臨床主要表現(xiàn)為產(chǎn)蛋下降的傳染性疾病，本實驗室從發(fā)病鴨群中分離、鑒定了呼腸孤病毒。為了對致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒(duckreovirus，DRV)進行診斷和防控，本研究分別建立了檢測DRV抗原和抗體的方法，包括兩個方面：一是以大腸桿菌表達的DRV6B蛋白作為包被抗原，建立檢測DRV抗體的間接ELISA方法；二是研制針對DRV的單克隆抗體，建立檢測DRV

3、抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS．ELISA)方法。采用RT-PCR擴增DRVZY／AH／1／2011株的oB基因，克隆到原核表達載體pET-32a(+)，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌Transetta(DE3)。含有重組質(zhì)粒pET-cB的大腸桿菌經(jīng)IPTG誘導，獲得大小為55ku的以包涵體形式表達的重組oB蛋白。Westem．blotting顯示重組oB蛋白能夠與兔抗DRV多抗血清特異性結(jié)合。以高親和NI-NTA樹脂在變性條件下純化重組cB蛋白，并用梯度尿素復性。將純化的重組aB蛋白作為包被抗原，建立了檢測鴨血清中DRV抗體的間接EL

4、ISA方法。以該方法和血清中和試驗對DRV感染鴨血清和SPF鴨血清進行檢測，兩者的符合率為100％。該方法與鴨瘟病毒、雛鴨肝炎病毒和禽流感病毒的陽性血清均無交叉反應，批內(nèi)變異系數(shù)小于11％、批問變異系數(shù)小于14％。采用差速離心和蔗糖密度梯度超速離心提純DRVZY／AH／1／2011，將其作為抗原免疫8周齡BALB／c小鼠，取免疫小鼠的脾細胞與SP2／0進行細胞融合。以純化的重組cB蛋白作為檢測抗原篩選陽性克隆，經(jīng)有限稀釋法亞克隆3～4次，獲得了6株穩(wěn)定分泌抗DRV單克隆抗體的雜交瘤細胞，依次命名為：2D7、2D10、2811

5、、682、4D7、7H9。經(jīng)鑒定單抗效價達l：1600-1：51200；其中單抗2D10的亞類為IgGl、其余5株單抗的亞類為IgG3；間接免疫熒光試驗顯示6株單抗與感染DRV的Vero細胞產(chǎn)生特異性反應；Western．blotting顯示6株單抗能夠與重組aB蛋白特異性結(jié)合；單抗2D10與682、4D7可能識別不同的抗揚州大學碩士學位論文原決定簇。分別以ProteinG樹脂純化的DRV兔多抗血清和2D10單抗為捕獲抗體和檢測抗體，建立了檢測DRV抗原的雙抗體夾心ELISA(DAS．ELISA)方法。該檢測方法的敏感性達O

6、．522gg／mL，與鴨瘟病毒、鴨病毒性肝炎病毒和禽流感病毒均無交叉反應，批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10％。上述結(jié)果表明，本研究建立的檢測致產(chǎn)蛋下降DRV的抗原或抗體方法具有良好的敏感性、特異性和重復性。關鍵詞：鴨呼腸孤病毒；原核表達；間接ELISA；單克隆抗體；雙抗體夾心ELISA孫陳莉：檢測致產(chǎn)蛋下降的鴨呼腸孤病毒抗原或抗體的ELISA方法的建立EstablishmentofELISAsfordetectingantibodyorantigenofduckreovirus(DRV)thatcausingduckegglay

7、ingdrop、，一?一一M．S．Candidate：SunChen—liAdvisor：Prof．WUYan．taoAbstractTheinfectionofreoviruscouldcausecontagiousdiseasethatwascharacterizedbyswellingnape，eyeconjunctivalcongestionorbleedingandextensivehemorrhageofinfectedducks．Since2010，avirulencecontagiousdiseaseemer

8、gedinsuccessiononegglayingducksinthesouthernpartofourcountry，anditwascharacterizedbyegglayingdrop．Reoviruswasisolatedandidentifiedfromtheilledduc