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1、呼腸孤病毒3型S1基因的原核表達(dá)及間接ELISA檢測(cè)方法的建立中文摘要呼腸孤病毒3型(reovimstype3，Reo．3)屬于呼腸孤病毒科(Reoviridae)、正呼腸孤病毒屬(0rthoreovims)、雙鏈RNA病毒【¨。呼腸孤病毒3型是實(shí)驗(yàn)動(dòng)物SPF級(jí)大鼠、小鼠、豚鼠、地鼠的必須檢測(cè)項(xiàng)目【21。其自然感染宿主比較廣泛【3】，如人類、小鼠、大鼠、猴、牛等，可隱性感染動(dòng)物并在體內(nèi)產(chǎn)生抗體，給血液制品、單克隆抗體、細(xì)胞培養(yǎng)等外來(lái)致病因子的檢定及動(dòng)物試驗(yàn)帶來(lái)一定的困難【4】。因此建立快速診斷方法十分必要。目前，檢測(cè)呼腸孤病毒3型主要用酶聯(lián)免疫吸附法(ELIS
2、A)檢測(cè)，其抗原獲得方法主要為細(xì)胞培養(yǎng)，但很難獲得高滴度的病毒；病毒雖可在雞胚內(nèi)增殖，但沒(méi)有規(guī)律性【51。本研究利用大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)pQE31表達(dá)呼腸孤病毒6l蛋白抗原部分，用純化的融合蛋白作為包被抗原建立ELISA方法，可用于呼腸孤病毒血清抗體的檢測(cè)。用生物學(xué)軟件DNAstar分析61蛋白，根據(jù)GenBank中報(bào)道的Reo．3S1基因序列(gi：61780)設(shè)計(jì)特異性引物，用一步法RT-PCR方法擴(kuò)增S1基因的主要抗原片段SR，將其插入到pMDl8．T載體中，酶切鑒定后測(cè)序。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒用勛乃I十勛，I雙酶切后連接到同樣雙酶切的表達(dá)載體pQE．31上，轉(zhuǎn)化
3、EcD，fM15(pREP．4)，IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行SDS．PAGE電泳和Westem-blot的結(jié)果表明，SR基因在EcD，fM15中獲得表達(dá)，表達(dá)蛋白SR．61分子質(zhì)量約為32kD，與預(yù)期大小相符，能與Reo．3陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng)，說(shuō)明SR．6l有很高的抗原性。把表達(dá)的SR．61重組蛋白經(jīng)初步純化后用作包被抗原，建立了檢測(cè)Reo．3血清抗體的間接ELISA方法，并確定了最適抗原包被濃度(0．6“g／mL)、最適血清稀釋度(1：100)、血清最適作用時(shí)間(150min)、最適封閉液(8％脫脂奶粉)、最適封閉時(shí)間(45min)、酶標(biāo)抗體最適稀
4、釋度(1：8000)、酶標(biāo)二抗最適作用時(shí)間(60min)、底物最適顯色時(shí)間(10min)和判定界值(0．292)。包被的重組抗原不與EcT(鼠痘病毒)、SeV(仙臺(tái)病毒)、MHV(小鼠肝炎病毒)、PVM(小鼠肺炎病毒)陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，表明建立的ELISA診斷方法具有良好的特異性。批內(nèi)重復(fù)試驗(yàn)和批間重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)均小于10％，說(shuō)明該方法具有很好的重復(fù)性。該診斷方法與國(guó)家實(shí)驗(yàn)動(dòng)物檢測(cè)中心建立的ELISA檢測(cè)試劑盒比較，特異性、敏感性和符合率分別為98．5％、100％和98．7％。上述結(jié)果表明該診斷方法具有良好的特異性和敏感性，顯示了良好的應(yīng)用前景。本研究成
5、功克隆了Reo一3S1基因，進(jìn)行了表達(dá)。利用表達(dá)的SR一6l蛋白成功建立了快速簡(jiǎn)便的ELISA診斷方法，為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的質(zhì)量控制、開(kāi)發(fā)商品化試劑盒提供了技術(shù)支持。關(guān)鍵詞：呼腸孤病毒3型；S1基因；原核表達(dá)：間接ELISAExpressionofS1GeneofreoVirustype3andEstablishmentofindirectELISAforDetectionofAntibodiesAgainstReo-3AbstractReoVimstype3(Reo一3)，aorthoreovimsoftheReoviridae，hasalineardouble。s
6、trandedRNAgenome．Reo一3isthemustdetectionprojectfortheSPFlevellaboratoryanimal，suchasrat，mouse，Caviaprocellusandhamster．Itsnatureinfectionhostisquitewidespread，suchashuman，rat，mouse，mom【ey，cattleandsoon，andcansilentinfectanimalandproducetheantibodyinViVo．Itbringsdimcultyfora11imaltes
7、tandtheextemalpathogenicfactorexaminationsuchasbloodproduct，monoclonalantibody，cellcultureetc．Thus，itisnecessarytoestablishaquickandaccuratediagnosticmethod．Ser0109icalmethods，suchastheenzyme—linkedimmunosorbentassay(ELISA)，arecommonlyusedtodetemlinewhetherlaboratoryanimalsareinfect
8、edwithReo．3．Theanti
