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1、分類(lèi)號(hào)：密級(jí)：UDC：編號(hào)：2013100906010772010級(jí)攻讀碩士學(xué)位研究生畢業(yè)論文牦牛多殺性巴氏桿菌OmpH基因的原核表達(dá)及免疫效果評(píng)價(jià)ExpressionandimmunoprotectiveofrecombinantoutermembranceproteinH(OmpH)ofPasteurellamultocidainYak指導(dǎo)教師：趙靜教授申請(qǐng)人姓名：安娜學(xué)科專(zhuān)業(yè)名稱(chēng)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學(xué)研究方向：高原畜禽生理學(xué)學(xué)院(系、部)：農(nóng)牧學(xué)院二零一三年六月QinghaiUniversityMasterDissertationExpressionandimmunoprotective
2、ofrecombinantoutermembranceproteinH(OmpH)ofPasteurellamultocidainYakSupervisor:Prof.ZhaoJingCandidate:AnNaAcademicMajorApplidedfor:BasicVeterinarySpecificMajor:Thedomesticfowlandlivestockphysiologyofqinghai-tibetplateauCollege(Department):AgricultureandAnimalHusbandrycollegeofQinghaiUniversityA
3、pril,2013課題來(lái)源:《青藏高原牦牛多殺性巴氏桿菌毒力相關(guān)基因及免疫學(xué)研究》(國(guó)家自然科學(xué)基金，項(xiàng)目編號(hào)：30960287項(xiàng)目起始日期：2010-2012)獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除文中已經(jīng)標(biāo)明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果。對(duì)本文的研究做出貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：日期：年月日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書(shū)本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門(mén)或機(jī)
4、構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)青海大學(xué)大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本論文屬于：保密□不保密□（請(qǐng)?jiān)谙鄳?yīng)方框內(nèi)打“√”），在_____年解密后適用本授權(quán)書(shū)。學(xué)位論文作者簽名：指導(dǎo)教師簽名：日期：年月日日期：年月日青海大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要摘要本文根據(jù)GenBank中巴氏桿菌外膜蛋白H(OmpH)基因核苷酸序列（登錄號(hào)：HM582882）分別設(shè)計(jì)了含信號(hào)肽和去信號(hào)肽兩對(duì)特異性引物，通過(guò)PCR方法擴(kuò)增青海省牦牛源多殺性巴氏桿菌（(Pasteurellamutocida，Pm)分
5、離株P(guān)0910的OmpH基因，分別得到含信號(hào)肽的OmpH片段(HM)和成熟外膜蛋白H的OmpH基因，再分別克隆到pMD19-TSimple載體上，然后進(jìn)行序列測(cè)定和分析。結(jié)果表明，含信號(hào)肽的基因全長(zhǎng)1005bp，包含一個(gè)完整的開(kāi)放閱讀框，編碼334個(gè)氨基酸，前20個(gè)氨基酸為信號(hào)肽序列。成熟外膜蛋白含有一個(gè)945bp的開(kāi)放閱讀框，編碼314個(gè)氨基酸。為了獲得可溶性的蛋白，本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了不同表達(dá)載體的選擇。首先將成熟外膜蛋白H基因克隆到pET-32a載體和pColdI載體上，分別轉(zhuǎn)入BL-21，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)表達(dá)后得到的重組蛋白幾乎都以包涵體形式存在。然后將OmpH基因克隆到pMAL-c2
6、x表達(dá)載體中，構(gòu)建原核重組表達(dá)質(zhì)粒pMAL-c2x-OmpH，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL-21并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明：重組融合蛋白（MBP-OmpH）大小為76KDa，且以包涵體和可溶形式存在。將可溶形式的蛋白經(jīng)親和層析柱進(jìn)行純化，得到了純度較高的OmpH融合蛋白，Western-blot檢測(cè)結(jié)果表明，重組融合蛋白能與全菌滅活苗免疫血清發(fā)生特異性反應(yīng)。將純化的重組融合蛋白、外膜蛋白和滅活全菌制成疫苗免疫小鼠，同時(shí)設(shè)生理鹽水對(duì)照組。免疫三次，間隔均為兩周。每次免疫后第14天對(duì)每組小鼠進(jìn)行斷尾采血并分離血清，通過(guò)ELISA檢測(cè)血清抗體效價(jià)。結(jié)果表明：重組蛋白組小鼠抗體水平明顯高于
7、免疫組和對(duì)照組。免疫3次后對(duì)小鼠進(jìn)行攻毒，結(jié)果表明：重組融合蛋白、外膜蛋白和全菌滅活苗組小鼠均能抵抗菌株P(guān)0910的致死性攻擊，對(duì)小鼠的保護(hù)率達(dá)到90%，生理鹽水對(duì)照組則完全沒(méi)有保護(hù)。綜上，本研究測(cè)定并分析了青海省牦牛源多殺性巴氏桿菌分離株P(guān)0910外膜蛋白H的基因序列，成功構(gòu)建了OmpH的可溶性原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得了重組融合蛋白。免疫小鼠和攻毒實(shí)驗(yàn)表明，重組融合蛋白具有良好的免疫原性，能夠誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生保護(hù)性抗體，為進(jìn)一步開(kāi)展多殺性巴氏桿菌OmpH的功能研究
