實驗10肌糖原的酵解作用

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1、實驗10肌糖原的酵解作用【實驗目的】學習檢定糖酵解作用的原理和方法，了解糖酵解作用在糖代謝過程川的地位及生理意義?！緦嶒炘怼吭趧游?、植物、微生物等許多生物機體內(nèi)，糖的無氧分解幾乎都按完全相同的過程進行。本實驗以動物肌肉組織屮肌糖原的酵解過程為例。肌糖原的酵解作用，即肌糖原在缺氧的條件下，經(jīng)過一系列的酶促反應，最后轉(zhuǎn)變成乳酸的過程。肌肉組織屮的肌糖原首先磷酸化，經(jīng)過己糖磷酸酯、丙糖磷酸酯、甘油磷酸酯等一系列中間產(chǎn)物，最后生成乳酸。該過程可綜合成下列反應式：l（CJiq.）a+HjO>2CH^CHOHCOOHB肌糖原的酵解作用是糖類供給組織能量的一種

2、方式。當機體突然需要大量的能量，而又供氧不足（如劇烈運動時），則糖原的酵解作用可暫時滿足能量消耗的需要。在有氧條件下，組織內(nèi)糖原的酵解作用受到抑制，而有氧氧化則為糖代謝的主要途徑。糖原酵解作用的實驗，一般使用肌肉糜或肌肉提取液。在用肌肉糜時，必須在無氧條件下進行；而用肌肉提取液，則可在有氧條件下進行。因為催化酵解作用的酶系統(tǒng)全部存在于肌肉提取液中，而催化呼吸作用（即三竣酸循壞和氧化呼吸鏈）的酶系統(tǒng)，則集中在線粒體中。糖原或淀粉的酵解作用，可由乳酸的生成來觀測。在除去蛋白質(zhì)與糖以后，乳酸可以與硫酸共熱變成乙醛，后者再與對疑基聯(lián)苯反應產(chǎn)生紫羅蘭色物質(zhì)，

3、根據(jù)顏色的顯現(xiàn)而加以鑒定。該法比較靈敏，每毫升溶液含1-5pg乳酸即給岀明顯的顏色反應。若有大量糖類和蛋白質(zhì)等雜質(zhì)存在，則嚴重干擾測定，因此實驗中應盡量除凈這些物質(zhì)。另外，測定時所用的儀器應嚴格地洗干凈?！緦嶒炘噭?、1.5%對疑基聯(lián)苯試劑：稱取對疑基聯(lián)苯1.5g,溶于100mL0.5%NaOH溶液屮，配成1.5%的溶液。若對耗基聯(lián)苯顏色較深，應用丙酮或無水乙醇重結(jié)晶。此試劑放置時間長久后，會出現(xiàn)針狀結(jié)品，應搖勻后使用。2、0.5%糖原溶液(或0.5%淀粉溶液)；3、15%偏磷酸(沉淀蛋白質(zhì)終止反應)4、氫氧化鈣(粉末)；5、濃硫酸；6、飽和硫酸

4、銅溶液：硫酸銅溶解度為20.7g(20°C)；7、1/15mol/L磷酸緩沖液(pH7.4)。A、1/15mol/L磷酸二氫鉀溶液：稱量9.078gKH2PO4溶于蒸餡水中，于1000mL容量瓶屮稀釋到刻度。B、1/15mol/L磷酸氫二鈉溶液：稱量11.876gNa2HPOi*21120(或23.894gNa2HPO4?12II20)溶于蒸徭水中，于1000mL容量瓶中稀釋到刻度。8、液體石蠟(隔絕空氣)【實驗材料】兔肌肉糜?！緦嶒炂鞑摹縆試管1.5x15cm(x8)及試管架；2、移液管5mL(x2),2mL(xD,1mL(x2)；3、滴管；4、

5、量筒10mL(x4)；5、玻璃棒；6、恒溫水??；7、沸水浴。8、小臺秤9、剪刀及銀子10、漏斗"、冰浴12.表面皿13、橡皮塞14、濾紙。【操作方法】一、制備肌肉糜獲取酶液將兔殺死后，放血，立即割取背部和腿部肌肉2.0g,在低溫條件下用剪刀盡量把肌肉剪碎成肌肉糜。向肌肉糜內(nèi)加入15mL磷酸緩沖液，攪拌均勻，以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心，5分鐘，收集上清液，即酶液（注意，應在臨用前制備）。二、肌糖原酵解1、取4支試管，編號，按下表操作:1（試驗管）2（試驗管）3（對照管）4（對照管）酶液（mL）33330.5%糖原溶液（mL）111115%偏磷酸（mL）2

6、2搖勻液體石蠟（mL）1111將4支試管同吋放入37°C恒濕水浴中保濕1?1.5小時15%偏磷酸（mL）222、0.5h后，取出試管，立即向1,2號管內(nèi)加入15%偏磷酸溶液2mL,混勻。將各試管內(nèi)容物分別以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，用滴管將液體石蠟小心棄掉，量取每個樣品的上清液4mL,分別加入到已編號的試管中，然后向每管內(nèi)加入飽和硫酸銅溶液1mL,混勻,再加入0.4g氫氧化鈣粉末，塞上橡皮塞后用力振蕩，放置30min,并不時攪動內(nèi)容物，使糖沉淀完全。將每個樣品分別以2500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，棄去沉淀。三、乳酸的測定1、取4支潔凈、干燥的試管，編

7、號，每個試管加入濃硫酸1.5mL,將試管至于冷水浴中，分別用小滴管取每個樣品的濾液1滴或2滴，逐滴加入到己冷卻的上述濃硫酸溶液中（注意滴管大小盡可能一致），隨加隨搖動試管，避免試管內(nèi)的溶液局部過熱。2、將試管混合均勻后，放入沸水浴中煮5min,取出后冷卻，再加入對疑基聯(lián)苯試劑2滴，勿將對疑基聯(lián)苯試劑滴到試管壁上，混勻試管內(nèi)容物，比較和記錄各試管溶液的顏色深淺，并加以解釋?！咀⒁馐马棥?1)對輕基聯(lián)苯試劑一定要經(jīng)過純化，使其呈白色。(2)在乳酸測定屮，試管必須潔凈、干燥，防止污染，影響結(jié)果。