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《玉米α-淀粉酶基因花粉特異表達載體構建及愈傷組織的遺傳轉化》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、萬方數據四川農業(yè)大學碩士畢業(yè)論文SichuanAgriculturalUniversityMasterDissertationConstructionandgenetictransformation，、1●，’^●Otpollen=specltlCvectorOt0c—amVlaSegene1nmalZeBy：XieChengcheng一(Major：BiochemistryandMolecularBiology)DirectedbyProfessorCaomo-juMaizeResearchinstituteSichuanagriculturalunivers
2、ityMav2014萬方數據四川農業(yè)大學碩士畢業(yè)論文論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學位論文是我個人在導師指導下進行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，學位論文中不包含其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農業(yè)大學或其它教育機構的學位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：謀程程M牛年多月／2日，關于論文使用授權的聲明本人完全了解四川農業(yè)大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子版
3、，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文。同意四川農業(yè)大學可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學位論文的全部或部分內容。研究生簽名：諒翟程翩硌扔蒴≥口
4、十年{)竅f≥日矽，畢年鈿，文日㈣呵腳7懿舢1㈣加萬方數據四川農業(yè)大學碩士畢業(yè)論文摘要玉米是我國第一大糧食作物，作為工業(yè)原料、農業(yè)飼料、口糧和種子在國民經濟的發(fā)展中占據舉足輕重的地位。但我國人口眾多，農村勞動力極度緊缺，隨著飼料消費和玉米深加工消費的增長，愈發(fā)顯現出我國人均玉米占有量低，剛性需求卻越來越大的矛盾。不育系制種是世界范圍內廣泛采用的提高玉米雜交種產量的重要手段。人們
5、在研究雄性不育機理的過程中逐漸加深了對植物生殖發(fā)育分子機理的研究，使得利用基因工程創(chuàng)造雄性不育系為作物育種開辟了一條嶄新的道路。美國先鋒公司發(fā)明的玉米SPT(SeedProductionTechnology)制種技術實現了核不育系的保持，不育系與保持系一系兩用，能夠方便有效區(qū)分可育株與不育株，選種時利用種子顏色差異可滿足全程機械操作，繁殖時只需隔離自交，雜交F1代皆為非轉基因種子，它使大規(guī)模安全利用雜種優(yōu)勢成為可能。本課題組經空間誘變獲得穩(wěn)定核不育系Sicau．ms，為使其能更快的應用于核不育系育種，實現核不育系的保持，本研究借鑒SPT制種技術的成功經驗，利用重
6、疊PCR和酶切連接相結合的方法構建出可以使花粉敗育的淀粉酶基因花粉特異表達載體，通過農桿菌介導法將淀粉酶基因花粉特異表達載體轉化優(yōu)良自交系18．599R的愈傷組織。研究結果如下：1．利用高保真酶KODFx，以B73葉片總DNA為模板擴增花粉特異表達啟動子Pg(X66692)，造粉體信號肽btl(NM001l12419)和苯磺胺代替物基因的終止子In2．1(NM00111963)，以18-599R萌發(fā)種子的cDNA為模板擴增01．淀粉酶基因(NM001156806)。通過目的片段回收測序，經NCBI進行序列比對，序列相似性分別為99％，100％，100％和95％。
7、2．利用降落重疊PCR(TD．SOE．PCR)方法將4個目的片段按啟動子Pg、信號肽btl、cc．淀粉酶基因、終止子In2．1的次序進行連接。設計具有反向互補末端的引物，分別以含4個目的片段的質粒為模板，用高保真酶KODFx擴增出具有反向互補粘性末端的目的片段，且在啟動子Pg的5’端和終止子In2．1的3’端分別引入酶切位點HindⅢ和EcoRI。采用降落重疊PCR(TD．SOE．PCR)的方法使具有互補鏈的各個片段通過重疊鏈的延伸拼接起來。將拼接后的淀粉酶基因表達盒連入零背景載體pEASY．B．Z后轉化大腸桿菌，挑取單克隆進行菌液擴繁，提取質粒送往公司測序，經
8、NCBI序列比對證實連接產物連接順序正確無誤，且序列相似性達99％。萬方數據四川農業(yè)大學碩士畢業(yè)論文3．將淀粉酶基因表達盒成功連入植物表達載體CPB。用內切酶HindIII$口EcoRI酶切連入了淀粉酶基因表達盒的零背景載體質粒，回收淀粉酶基因表達盒。并用HilldⅡI和EcoRI酶切表達載體CPB的質粒，獲得線性化載體。利用T4DNA連接酶將二者進行連接。成功連接后將淀粉酶基因特異表達載體進行大腸桿菌的轉化，涂于抗kana的平板上，12．16h后挑取單克隆進行擴繁，提取質粒，用EcoRI和HindHI37℃酶切過夜后進行瓊脂糖凝膠電泳，并以原始的CPB質粒為陰
9、性對照，以淀粉酶基因表達
