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《癌睪抗原ctnna2的hla-a2限制性ctl表位鑒定及磷酸化修飾》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、AthesissubmittedtoZhengzllouUniVers塒fort11edegreeofMasterIdentificationandPhosphorylationModincationofHLA-A2RestrictedCytotoxicTLymphocyteEpitopesfromCancer／TestisAntigenCTNNA2Aumor：JingLiu■一Supervisor：Pro￡Ⅷ1f．engGaoM句or：Biochemis蚵andMolecularBiologySch001ofLifeSciencesApril2014原創(chuàng)性聲明本
2、人鄭重聲明：所呈交的學位論文，是本人在導師的指導下，獨立進行研究所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的科研成果。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本聲明的法律責任由本人承擔。學位論文作者：剎萌日期：加肛年廠月f日學位論文使用授權聲明本人在導師指導下完成的論文及相關的職務作品，知識產(chǎn)權歸屬鄭州大學。根據(jù)鄭州大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，同意學校保留或向國家有關部門或機構(gòu)送交論文的復印件和電子版，允許論文被查閱和借閱：本人授權鄭州大學可以將本學位論文的全部或部分編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索
3、，可以采用影印、縮印或者其他復制手段保存論文和匯編本學位論文。本人離校后發(fā)表、使用學位論文或與該學位論文直接相關的學術論文或成果時，第一署名單位仍然為鄭州大學。保密論文在解密后應遵守此規(guī)定。學位論文作者：刻婧日期：瀝佯年∥月r日摘要近年來，癌癥已成為全球最大致死原因。嚴峻的形勢使得癌癥的防治刻不容緩。目前，隨著生物及醫(yī)學研究技術的發(fā)展，腫瘤免疫治療逐漸被廣泛用于癌癥的臨床治療。而腫瘤疫苗是腫瘤免疫療法的研究熱點之一，現(xiàn)在所研發(fā)的疫苗以治療型居多。其中多肽疫苗作為治療型腫瘤疫苗，具有高特異性、易于人工合成，使其在抗腫瘤研究中受到愈多的關注。多肽疫苗的設計核心是T細胞
4、表位，其鑒定和改造是多肽疫苗發(fā)展及應用的基礎。目的本課題的研究目的是預測、篩選及鑒定來源于癌／睪丸抗原Cn州A2的HLA．A2限制性的CD8+CTL表位。同時對4位是絲氨酸的表位，嘗試磷酸化修飾，即在此位引入磷酸化的絲氨酸，并探討對表位免疫原性的影響。方法首先，我們通過使用免費在線預測工具BIMAS、NetCTLl．2及SYFPEITm進行預測，得到Cn心IA2來源的HLA．A2限制性CTL表位，同時嘗試磷酸化的引入。然后，將預測得到的9肽序列，經(jīng)固相Fmoc法合成，I沖．瑚)LC色譜法純化，質(zhì)譜儀分析得到候選肽的分子量。其次，使用T2細胞，通過親和力測定及復合物
5、穩(wěn)定性分析，對所有的CnⅢA2候選表位進行篩選。RT-PCR分析腫瘤細胞中Cn州A2的表達，篩選得到靶細胞。最后，對3名健康者的外周血單核細胞進行分離及誘導培養(yǎng)，得到特異性的效應細胞。通過ELISPOT、ICS及細胞毒活性等實驗來研究CDⅢA2表位的免疫原性。結(jié)果1．綜合三種預測工具BIMAS、NetCTLl．2和SYFPEI聊，選擇11條C刪A2來源的短肽表位，分別是：P129(ALLSAVTRL)、P138(LILADMADV)、P148(RLLSHLKjV)、P279(ALNEFDNKI)、P345(LLSEYA心小IT)、P495(VITEAVDDI)、P
6、569(KVLB盯KLL)、P581(VMPIUFAEQV)、P721(IMMEMTDFT)、P779(LMNAVVL]rV)和P784(Ⅵ，TVKASYV)，同時在P129和P148的4位處引入磷酸化的Ser。經(jīng)Fmoc法合成，質(zhì)譜驗證所有肽的分子量。摘要2．源于Cn州A2的P148和P581的實驗結(jié)果FI>1．5，可說明親和力高：P129、P138、P345和P721這4條肽的親和力結(jié)果較高(FI>1)：P148和P581與HLA．A木0201的復合物穩(wěn)定性最好(DC50>6h)；P138、P345和P721這3條肽的穩(wěn)定性結(jié)果DC50>4h，P129則穩(wěn)定性
7、一般；兩條4位pSer的修飾肽與原肽相比，結(jié)合力提高了，尤其是P129．4。Ds。，，／HLA．A木0201的DC50得到明顯改善。3．ELISPOT和ICS實驗檢測CnmA2原肽及磷酸化肽體外誘導特異性CTLs的能力。除P345外，P129、P138、P148、P581和P721這5條肽效果明顯。其中P138、P581和P721在這兩實驗中的結(jié)果都非常明顯；ICS實驗結(jié)果顯示P129．4。ps。，)和P148．4。ps。。)肽特異性的CTL能分泌大量的IFN吖，但在ELISPOT實驗中，相比原肽它們的結(jié)果較明顯。4．LDH釋放及CFSE染色等細胞毒活性檢測實驗中
8、，所有的C
