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《基于pedv s重組蛋白間接elisa抗體檢測(cè)方法的建立與單克隆抗體的制備》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)：墨墨5墨：2墨密級(jí)：公玨單位代碼：!QQ墨互學(xué)號(hào)：2Q!鱧21基于PEDVS重組蛋白間接ELISA抗體檢測(cè)方法的建立與單克隆抗體的制備EstablishmentofindirectELISAfordetectingmethodandpreparationofmonoclonalantibodyofPEDVSl‘·orecombinantprotein學(xué)位申請(qǐng)人：王晨楓指導(dǎo)教師：范京惠副教授左玉柱副教授學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一三年六月一日獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研
2、究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得塑i墾盎些盤堂或其他教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：辛耘機(jī)簽字日期：洄刁年()月1日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解塑韭壅些盤鱟有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)塑皇墾壅些盤堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用
3、影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：辦影機(jī)導(dǎo)師簽名：菇東南簽字日期：渺I≥年毛月1日簽字日期：汕Jj年6月／日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：電話：郵編：嬲摘要豬流行性腹瀉(Porcineepidemicdiarrhea,PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起的，以豬嘔吐、嚴(yán)重腹瀉脫水為主要臨床癥狀特征的高度接觸性傳染病。不同年齡和不同品種的豬均易感，哺乳仔豬死亡率達(dá)95％以上。近年來，PED的流行區(qū)域有逐漸擴(kuò)大的
4、趨勢(shì)，危害嚴(yán)重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，PED的及時(shí)確診和防治研究具有重要的意義。根據(jù)GenBank中已經(jīng)發(fā)表的豬流行性腹瀉病毒毒株的s基因序列并參照PMDl9．T載體圖譜，設(shè)計(jì)了l對(duì)分別插入限制性內(nèi)切酶BamHI和XhoI酶切位點(diǎn)的引物，采用PCR技術(shù)從豬流行性腹瀉病毒HB／FN株中擴(kuò)增得到一條1080bp的s基因片段。將其連入pMDl9．T載體中，再轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)酶切鑒定篩選出陽性克隆后進(jìn)行測(cè)序，測(cè)序結(jié)果和GenBank上發(fā)表的S基因的核苷酸序列根據(jù)抗原性分析選擇其抗原性較高的s基因片段，設(shè)計(jì)特異性引物，經(jīng)PCR擴(kuò)增得到
5、655bp的基因片段，將此基因片段亞克隆插入到原核表達(dá)載體pET一28“+)中，構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET．28“+)．SFN，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到表達(dá)菌株E．coliBL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后用SDS—PAGE分析，結(jié)果顯示S重組蛋白的分子質(zhì)量約為25ku，與預(yù)計(jì)的蛋白分子量一致。利用His標(biāo)簽的特性對(duì)S重組蛋白進(jìn)行純化，SDS．PAGE分析顯示純化效果好，無雜帶。Western-blot試驗(yàn)證明，純化的s重組蛋白可以與PEDV陽性血清產(chǎn)生特異性結(jié)合反應(yīng)，證明該蛋白抗原性好。利用純化的s重組蛋白作為包被抗原，通過各步反應(yīng)條件的優(yōu)化，最終確定了檢測(cè)
6、PEDV抗體的重組S蛋白間接ELISA方法最佳反應(yīng)條件：抗原經(jīng)4‘C包被過夜：用封閉液(含5％新生牛血清的PBST)37℃封閉1h；待檢血清(用封閉液做1：100倍稀釋)100uL于37℃反應(yīng)1h；酶標(biāo)二抗(用封閉液做l：1000倍稀釋)100laL于37℃反應(yīng)45min；加入底物后避光顯色15min；加入終止液50uL后測(cè)定OIM50nm。該方法與TGEV、CSFV、PRV、PRRSV等陽性血清不發(fā)生交叉反應(yīng)，重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，變異系數(shù)均值都小于lO％，表明本方法具有較好的特異性和重復(fù)性。用純化的PEDV重組HIS標(biāo)簽s蛋白做為免疫原，按常規(guī)方法免疫
7、BALB／c小鼠，利用淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)，制備單克隆抗體(MeAb)。經(jīng)細(xì)胞融合獲得l株可穩(wěn)定分泌特異性McAb的抗PEDVS蛋白的雜交瘤細(xì)胞，命名為1F2。雜交瘤上清與s蛋白抗原包被的ELISA反應(yīng)為陽性。Westernblotting試驗(yàn)證明，1F2可以與PEDVS蛋白產(chǎn)生特異性反應(yīng)，為膠體金免疫層析試紙條的制備奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：PEDV；S基因；原核表達(dá)：ELISA；單克隆抗體EstablishmentofindirectELISAfordetectingmethodandpreparationofmonoclonalantibodyofPE
8、DVSrecombinantproteinAbstractCandidate：W
