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《基于S蛋白檢測(cè)豬流行性腹瀉抗體間接ELISA方法的建立.pdf》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、河南農(nóng)業(yè)科學(xué)，2013，42(8)：119-123JournalofHenanAgricuhuralSciences基于S蛋白檢測(cè)豬流行性腹瀉抗體間接ELISA方法的建立鄧祖麗穎(鄭州幼兒師范高等?？茖W(xué)校，河南鄭州450000)摘要：為建立檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒(PEDV)S蛋白抗體的間接ELISA方法，應(yīng)用RT—PCR方法擴(kuò)增PEDV河南流行毒株S基因794bp片段，將其克隆至原核表達(dá)栽體pET一32a(+)，構(gòu)建pET一32a—S重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21，在37℃條件下加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS—PAGE分析顯示，該蛋白以融合蛋白形式
2、高效表達(dá)，分子量約為46．9kD；Western—blot分析表明，所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以純化的S蛋白為包被抗原建立檢測(cè)PED抗體的間接ELISA方法，試驗(yàn)確定抗原最佳包被量為0．04ug／~L，血清最佳稀釋度為1：1OO，HRP—IgG二抗最佳稀釋度為1：2000，陽(yáng)性判定標(biāo)準(zhǔn)為OD。值≥0．24。應(yīng)用該方法對(duì)采自河南省不同地區(qū)23個(gè)養(yǎng)豬場(chǎng)的279份血清樣本進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，母豬血清樣本PED抗體陽(yáng)性率為97．42(227／233)；育肥和保育豬血清樣本陽(yáng)性率為71．74(33／46)。試驗(yàn)結(jié)果表明，所建立的間接ELISA方法特異
3、性、靈敏性和可重復(fù)性良好，可以用于豬群PED抗體水平監(jiān)測(cè)和流行病學(xué)調(diào)查。關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；S蛋白；原核表達(dá)；酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)中圖分類號(hào)：$858．28文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A文章編號(hào)：1004—3268(2013)08—0119—05ProkaryoticExpressionofPEDVSProteinandDevelopmentofIndirectELISAforDetectionofItsAntibodyDENGZULi—ying(ZhengzhouInfantNormalSchool，Zhengzhou450000，China)Abstract：
4、Aspike(S)protein—basedELISAwasdevelopedtodetecttheantibodiesagainstporcineepidemicdiarrheavirus(PEDV)．The794pfragmentofSgenefromPEDVHenanisolatewasamplifiedbyRT—PCRandinsertedintotheexpressionvectorpET_32a(+)．TherecombinantplasmidwasnamedaspET-32a—S．Afusionproteinwasexpressedin
5、BL21thattransfectedbypET一32a—SandinducedbyIPTG．Themolecularweightoftherecombinantproteinwasabout46．9kDanalyzedbySDS—PAGE，andtheimmunoreactionactivityoftherecombinantproteinwasconfirmedbyWestern—blot，inwhichpositiveserumagainstPEDVwasused．AnindirectELISAfordetectingantibodiesaga
6、instPEDVwasdevelopedbyusingexpressedSproteinascoatinganti—gen．TheresultsshowedthattheoptimalcoatingconcentrationforSproteinwas0．04rig／well，theserumdilutionwas1：100，andtheHRP—IgGdilutionfoldwas1：2000．Thepositivecriteri—onforthisELISAassaywasOD45o≥0．24．Foratotalof279fieldsamplest
7、ested，thepositiveratesofSOWserum，nurseryandfatteningpigserumwere97．42(227／233)and71．74(33／46)，respectively．TheresultsindicatethatthisassayiSspecific，sensitiveandreproducible，whichmightbesuitablefordetectinganti—PEDVantibody．Keywords：PEDV；Sprotein；prokaryoticexpression；ELISA收稿日期
8、：2013—02—28作者簡(jiǎn)介：鄧祖麗穎(196f一)，女，河南鄭州人，高級(jí)講師，碩士，主要從事生物技術(shù)教學(xué)
