資源描述:
《含甲氧基黃酮類化合物ugt代謝特征及其機理的研究》由會員上傳分享,免費在線閱讀,更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、摘要黃酮類化合物(Flavonoids)是一類多酚類物質(zhì),廣泛存在于自然界的豆類、谷類、水果、蔬菜及許多藥用植物中。大量研究報道表明黃酮類化合物可以清除自由基,具有抗氧化、抗炎、保護心血管等多種生物活性、藥理作用,其抗腫瘤作用更是受到廣泛關注。但是,黃酮類化合物口服生物利用度低,阻礙了具有實用價值的化學預防治療制劑研發(fā)。因而,如果想把該類化合物研發(fā)為疾病預防治療制劑,尋找提高其生物利用度的有效途徑是關鍵需解決的問題。黃酮類化合物在體內(nèi)的代謝情況復雜,廣泛存在的葡萄糖醛酸化代謝、硫酸化代謝,是導致其生物利用
2、度低的重要原因;其中,經(jīng)尿苷二磷酸葡萄糖苷酸轉(zhuǎn)移酶(UDP.Glucuronosyltransferases,UGTs)催化的葡萄糖醛酸化反應是主要的代謝途徑。以往研究表明,黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝具有一定的底物特異性,該代謝受到其復雜化學結(jié)構(gòu)變化如甲氧基、羥基變化影響,其中羥基變化對于黃酮類化合物葡萄糖醛酸化代謝的影響研究較多;此外,最近發(fā)現(xiàn)含甲氧基黃酮所具有的化學預防能力往往優(yōu)于非甲氧基黃酮類化合物。因此,本論文重點研究含甲氧基黃酮類化合物的葡萄糖醛酸化代謝特征及機理。為了研究含甲氧基黃酮類化合
3、物的葡萄糖醛酸化代謝規(guī)律,選定了兩個單甲氧基5,7.二羥基黃酮化合物:漢黃芩素(Wogonin)和千層紙黃素(OroxylinA),以及三個含甲氧基5.單羥基黃酮化合物:楊芽黃素(Tectochrysin,5.hydroxy一7-methoxyflavone,5H7MF)、5.羥基.7,8一二甲氧基黃酮(5.hydroxy.7,8.dimethoxyflavone,5H7,8MF)、5.羥基.6,7,8,4’.四甲氧基黃酮(5一hydroxy.6,7,8,4’一中文摘要tetramethoxyflavon
4、e,5H6,7,8,4’MF)做為模型化合物。其中,前兩個化合物含兩個酚羥基,結(jié)構(gòu)中甲氧基位置有微小變化;而后三個化合物含單個酚羥基,A環(huán)上所含甲氧基數(shù)量依次遞增。擬用12種商品化人源重組UGT酶以及人體肝、腸微粒體,在體外對這五個化合物進行系統(tǒng)葡萄糖醛酸化代謝研究,尋找出其代謝規(guī)律、代謝特征,并擬達到以下目的:1、對這些化合物進行葡萄糖醛酸化代謝特征研究,得到其UGT酶特異性代謝指紋圖譜(UGT.isoformspecificmetabolicfingerprint,GSMF)。2、分析UGT酶代謝行為
5、特征,尋找其與人體主要代謝器官肝、腸的葡萄糖醛酸化代謝情況之間的相關性,并運用UGT酶催化的葡萄糖醛酸化代謝特征對肝、腸特異性葡萄糖醛酸化代謝情況進行預測。3、分析化學結(jié)構(gòu)變化如甲氧基位置、數(shù)量變化,對模型化合物UGT酶特異性代謝特征的影響。主要研究方法如下:一、人肝、腸微粒體和人源UGT酶的酶活性實驗為了得到各模型黃酮化合物的GSMF,重要UGT的特異性代謝動力學情況及器官特異性葡萄糖醛酸化代謝情況,在體外運用器官微粒體和UGT酶測定酶活性。酶孵育實驗步驟如下:(1)混合微粒體或UGT酶(反應最佳終濃度
6、范圍是0.0053~0.053毫克蛋白每毫升)、氯化鎂0.88mM、葡糖二酸單內(nèi)酯4.4mM、丙甲菌素0.022mg/ml;含有不同濃度底物的50mM磷酸氫二鉀溶液(pH7.4);以及UDPGA(3.5mM)。(2)將混合后終體積為680pl的混合物平均分以得三等份,每份200I.tl,置于370C按預設時間(10至60min)同時孵育。(3)加入內(nèi)含90“M苯乙酮的94%乙腈6%醋酸溶液(作內(nèi)標,其中漢黃芩素、千層紙黃素、5H6,7,8,4’MF用苯乙酮,而5H7MF、5H7,8MF換為苯丙酮)終止反應
7、。終止反應后的混合液于13,000rpm離一t∑,15分鐘,取上清液進行UPLC分析。測定GSMF時,僅采用了高、中、低三個底物濃度2.5,10以及35laM。描繪UGT代謝動力學情況時,如UGT1A1,1A3,1A7.1A10對漢黃芩素、千層紙黃素代謝情況,采用了1.25.35“M(O.5.35洲)范圍內(nèi)9.11個底物濃度。ll博士學位論文二、UPLC分析方法為了對各模型化合物及代謝產(chǎn)物進行分析定量,采用了以下UPLC方法:對于漢黃芩素、千層紙黃素及其相應葡萄糖醛酸化代謝物,分析系統(tǒng)為WatersAcq
8、uityUPLC,采用光二極管陣列檢測器(DAD)及Empower軟件。分離柱為BEHC18,1.7gm,2.1×50illnl。流動相B為100%乙腈,流動相A為0.1%(v/V)甲酸水溶液(pH2.5)。流速為0.4ml/min,采用梯度洗脫,o~1.5分鐘時,流動相B占30.40%:1.5~2.5分鐘時,流動相B占40.70%;2.5~3.0分鐘時,流動相B占70.30%。檢測波長280nlll,注入樣品體積10¨l。對