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1、SOOCHOWUNIVERSITY碩士學(xué)位論文論文題目TGF-βRⅡ靶向并激活NK-92細(xì)胞的腫瘤免疫治療作用研究生姓名王仲娟指導(dǎo)教師姓名劉海燕專業(yè)名稱免疫學(xué)研究方向腫瘤免疫論文提交日期2013年4月TGF-βRⅡ靶向并激活NK-92細(xì)胞的腫瘤免疫治療作用中文摘要中文摘要目的：很多腫瘤可以通過分泌TGF-β抑制NK及T淋巴細(xì)胞的功能，促進(jìn)腫瘤的發(fā)生與發(fā)展。NK細(xì)胞有激活和抑制型兩種受體，NK細(xì)胞是否有殺傷功能取決于它所接受的激活型信號(hào)和抑制型信號(hào)的強(qiáng)弱。NKG2D是NK細(xì)胞的激活型受體，其信號(hào)可以介導(dǎo)NK細(xì)胞的殺傷功能。因此我們首先克隆了TGF-βRⅡ的胞外段和跨
2、膜區(qū)以及NKG2D的胞內(nèi)段（TN）基因，用重疊延伸拼接PCR（SOE-PCR）的方法將兩段基因拼接起來。并采用了慢病毒感染的方法制備了攜帶TN的NK-92穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。表面TGF-βRⅡ的表達(dá)可以將NK細(xì)胞靶向到高表達(dá)TGF-β的腫瘤微環(huán)境，與TGF-β的結(jié)合可以激活NKG2D的活化信號(hào)，即激活NK細(xì)胞的殺傷功能；與微環(huán)境中TGF-β的結(jié)合還能夠降低其對(duì)其它細(xì)胞的抑制及對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的誘導(dǎo)。我們通過體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究了攜帶TN的NK-92細(xì)胞的腫瘤免疫治療作用。方法：（1）采用RT-PCR和重疊延伸PCR獲得TN基因，構(gòu)建含有重組TN基因的慢病毒穿梭質(zhì)粒，并與其它包
3、裝質(zhì)粒一起通過磷酸鈣轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，得到假病毒，用于感染NK-92細(xì)胞，獲得攜帶TN基因的NK-92細(xì)胞系。（2）通過Elisa方法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞分泌TGF-β1的分泌，獲得高表達(dá)TGF-β1用于腫瘤殺傷和動(dòng)物模型的腫瘤細(xì)胞系（3）通過Transwell實(shí)驗(yàn)，CellCountingKit-8（CCK8）表達(dá)檢測(cè)NK-92-TN細(xì)胞的遷移及存活能力。（4）通過細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)，流式細(xì)胞術(shù)方法分析NK-92-TN的腫瘤細(xì)胞殺傷能力和激活程度。+（5）通過將臍血來源的CD4T細(xì)胞在TGF-β1誘導(dǎo)下與NK-92-TN細(xì)胞共培養(yǎng)，檢測(cè)其對(duì)調(diào)節(jié)性T細(xì)胞分化的影響。（6）采用肝癌
4、SMMC7721細(xì)胞移植腫瘤裸鼠模型，研究NK-92-TN細(xì)胞的腫瘤免疫治療作用。I中文摘要TGF-βRⅡ靶向并激活NK-92細(xì)胞的腫瘤免疫治療作用結(jié)果：（1）成功克隆了TGF-βRⅡ的胞外段和跨膜區(qū)以及NKG2D的胞內(nèi)段（TN）這一段融合基因，獲得了慢病毒重組穿梭質(zhì)粒，并與其它包裝質(zhì)粒一起通過磷酸鈣法感染293T細(xì)胞，獲得了NK-92-TN穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系。（2）檢測(cè)發(fā)現(xiàn)SMMC7721，HepG2肝癌細(xì)胞可以分泌較高水平的TGF-β1。（3）通過CCK-8檢測(cè)和Transwell實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，NK-92-TN細(xì)胞的存活和遷移能力較對(duì)照細(xì)胞系更強(qiáng)。（4）與對(duì)照細(xì)胞系相比，
5、NK-92-TN細(xì)胞表面NKG2D的表達(dá)更高，且不受TGF-β1的抑制。同時(shí)較對(duì)照細(xì)胞其IFN-γ分泌水平較高。（5）與對(duì)照細(xì)胞系相比，NK-92-TN細(xì)胞的腫瘤殺傷作用更強(qiáng)，而且在TGF-β1的刺激下，NK-92-TN細(xì)胞的殺傷作用提高，表明TGF-β1對(duì)NK-92-TN細(xì)胞具有活化作用。（6）與對(duì)照組相比，NK-92-TN細(xì)胞能夠抑制調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分化，且具有劑量依賴性。（7）體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證明了NK-92-TN細(xì)胞聯(lián)合低劑量放療能夠有效地抑制肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)。結(jié)論：本研究所構(gòu)建的NK-92-TN細(xì)胞系較對(duì)照細(xì)胞呈活化狀態(tài)，并且在TGF-β1的作用下，其活化、遷移
6、及殺傷活性不僅沒有受到抑制，反而被進(jìn)一步激活。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)也初步證明了NK-92-TN細(xì)胞治療能夠有效地抑制肝癌的生長(zhǎng)。關(guān)鍵詞：NK-92-TN，TGF-β1，細(xì)胞毒，腫瘤免疫治療，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞作者：王仲娟指導(dǎo)老師：劉海燕IITGF-βRⅡ靶向并激活NK-92細(xì)胞的腫瘤免疫治療作用英文摘要TumorimmunotherapyusingNK-92cellscarryingTGF-βreceptorⅡandNKG2DAbstractObjective：TumorcellscouldinhibitNKandTcellfunctionandpromotetumordevelo
7、pmentthroughTGF-β1secretion.ThecapacityofNKcellstokilltumorcellsdependsonthecombinedeffectofsuppressiveandstimulatorysignalsdeliveredthroughsurfacereceptors.NKG2DisoneofthemajoractivationreceptorsonNKcells.ThereforewefirstclonedtheTGF-βRⅡextracellularandtransmembraneregionsandintracel
8、lular
