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《抗豬流行性腹瀉病毒噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及真核表達(dá)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、分類號(hào)密級(jí)UDC單位代碼碩士學(xué)位論文抗豬流行性腹瀉病毒噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及真核表達(dá)ConstructionandEukaryoticExpressionofaphagescFvlibraryagainstPorcineEpidemicDiarrheaVirus研究生姓名孫舉指導(dǎo)教師尹燕博教授畢玉海副研究員學(xué)科專業(yè)預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向動(dòng)物傳染病防治與生物制品學(xué)中國.青島二0一八年六月ConstructionandEukaryoticExpressionofaphagescFvlibraryagainstPorci
2、neEpidemicDiarrheaVirusThesissubmittedtoQingdaoAgriculturalUniversityInFulfillmentoftheRequirementfortheDegreeofMasterofAgronomySunJu（CollegeofAnimalVeterinaryMedicine）Supervisor:Prof.YinYan-boAssociateProf.BiYu-haiQingdao.ChinaJune,2018獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師
3、指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得青島農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時(shí)間：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的說明本人完全了解青島農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意青島農(nóng)業(yè)大學(xué)可以用不
4、同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。研究生簽名：時(shí)間：年月日導(dǎo)師簽名：時(shí)間：年月日青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要抗豬流行性腹瀉病毒噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建及真核表達(dá)摘要本研究通過噬菌體展示的技術(shù)構(gòu)建抗豬流行性腹瀉病毒的單鏈抗體庫，進(jìn)而構(gòu)建完整抗體用來診斷和治療豬流行性腹瀉，減少該疫病對(duì)養(yǎng)豬業(yè)的經(jīng)濟(jì)損失，促進(jìn)其健康發(fā)展，具有極為重要的意義，具體內(nèi)容如下：試驗(yàn)一抗豬流行性腹瀉病毒噬菌體單鏈抗體庫的構(gòu)建利用豬流行性腹瀉疫苗加強(qiáng)免疫發(fā)病耐過的豬群，收集提取外周血淋巴細(xì)胞的總RNA，經(jīng)Random6或特異性引
5、物反轉(zhuǎn)錄形成cDNA。從GenBank數(shù)據(jù)庫及IMGT數(shù)據(jù)庫中檢索已經(jīng)登入的豬抗體序列，對(duì)其抗體序列進(jìn)行分析，分析得到序列中的可變區(qū)以及恒定區(qū)，在高保守區(qū)設(shè)計(jì)引物，得到9條重鏈引物，6條輕鏈（Kappa）引物以及5條輕鏈（Lambda）引物。以反轉(zhuǎn)錄的cDNA為模板，擴(kuò)增豬的重鏈及輕鏈可變區(qū)，將獲得的重鏈和輕鏈的擴(kuò)增片段通過Linker接頭連接，克隆到pComb3XSS噬菌體載體質(zhì)粒中，以構(gòu)建scFv噬菌體單鏈抗體文庫，并通過PCR和測序的方法鑒定其正確性及多10樣性，原始庫量約為9.5×10pfu/mL，成功構(gòu)
6、建了豬源抗豬流行性腹瀉病毒的噬菌體單鏈抗體庫。試驗(yàn)二抗豬流行性腹瀉病毒噬菌體單鏈抗體庫的鑒定及篩選以豬流行性腹瀉重組S蛋白為抗原包被96孔酶標(biāo)板，經(jīng)過3輪“吸附-洗脫-富集”的篩選過程，將篩選得到的噬菌體重組載體感染感受態(tài)XLI-Blue,增殖后涂布于培養(yǎng)基平皿上，挑單個(gè)菌落測序，進(jìn)行序列分析，并通過Phage-ELISA鑒定陽性重組抗體。篩選得到1株與豬流行性腹瀉S蛋白結(jié)合特異性較高的噬菌體單鏈抗體。試驗(yàn)三抗豬流行性腹瀉病毒豬源完整抗體的構(gòu)建及真核表達(dá)將篩選得到的1株與豬流行性腹瀉S蛋白結(jié)合特異性較高的噬菌體單
7、鏈抗體進(jìn)行序列分析，設(shè)計(jì)引物，擴(kuò)增出VH區(qū)和VL區(qū)，與CH區(qū)和CL區(qū)進(jìn)行搭橋PCR，擴(kuò)增出的產(chǎn)物連接表達(dá)質(zhì)粒pCAGGS，轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞真核表達(dá)，進(jìn)行蛋白純化。經(jīng)SDS-PAGE和Westernblot分析鑒定，表達(dá)產(chǎn)物的分子質(zhì)量約為150KD。為下一步中和試驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)，為抗豬流行性腹瀉病毒的單克隆抗體制備提供了理論依據(jù)。青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；噬菌體；單鏈抗體；真核表達(dá)青島農(nóng)業(yè)大學(xué)碩士學(xué)位論文AbstractConstructionandEukayoticExpress
8、ionofaphagescFvlibraryagainstPorcineEpidemicDiarrheaVirusAbstractThesingle-chainantibodylibraryagainstporcineepidemicdiarrheaviruswasconstructedbyphagedisplaytoconstructancompletelyantibo
