a族鏈球菌m蛋白在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)中的作用

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1、河北醫(yī)科大學(xué)學(xué)位論文使用授權(quán)及知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸屬承諾本學(xué)位論文在導(dǎo)師(或指導(dǎo)小組)的指導(dǎo)下，由本人獨(dú)立完成。本學(xué)位論文研究所獲得的研究成果，其知識(shí)產(chǎn)權(quán)歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。河北醫(yī)科大學(xué)有權(quán)對(duì)本學(xué)位論文進(jìn)行交流、公開和使用。凡發(fā)表與學(xué)位論文主要內(nèi)容相關(guān)的論文，第一署名單位為河北醫(yī)科大學(xué)，試驗(yàn)材料、原始數(shù)據(jù)、申報(bào)的專利等知識(shí)產(chǎn)權(quán)均歸河北醫(yī)科大學(xué)所有。否則，承擔(dān)相應(yīng)的法律責(zé)任。研究生簽糾篆本≯導(dǎo)師簽章嬲?學(xué)院領(lǐng)導(dǎo)蓋載糞鋈c,]ol號(hào)年唯月／日研究生學(xué)位論文獨(dú)創(chuàng)性聲明‘·、本論文是在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果，除了文中特別加以標(biāo)注等內(nèi)容外，文中不包含其他人已發(fā)表或撰寫的研

2、究成果，指導(dǎo)教師對(duì)此進(jìn)行了審定。本論文由本人獨(dú)立撰寫，文責(zé)自負(fù)。研究生簽名：j冶彳≥導(dǎo)師簽章：旃芎≥吖弓年匕月／El目錄中文摘要??????????????????????????．1英文摘要??????????????????????????．4研究論文A族鏈球菌M蛋白在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)中的作用—1上．—jL一日IJ百??????????????????????????·8材料與方法???????????????????????．9結(jié)果?????????????????????????．．27附圖?????????????????????????．．28附表??

3、???????????????????????．．39討{侖?????????????????????????．．41結(jié)論?????????????????????????．．43參考文獻(xiàn)???????????????????????．．44綜述A族鏈球菌M蛋白的分型及致病機(jī)制?????????．46致謝???????????????????????????．．55個(gè)人簡(jiǎn)歷?????????????????????????．．56中文摘要A族鏈球菌M蛋白在誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞活化及調(diào)節(jié)中的作用摘要目的：A族鏈球菌(GroupAstreptOCOCCUS，GAS)是一種以人類為唯

4、一宿主的細(xì)菌，感染后若治療不及時(shí)可引發(fā)多種嚴(yán)重的疾病。本室在GAS致炎機(jī)制及免疫逃逸方面做了大量工作。M蛋白位于GAS的表面，是它的主要的毒力因子，研究顯示M蛋白有著較強(qiáng)的致炎能力，且有助于GAS逃避巨噬細(xì)胞的吞噬。結(jié)合本室前期工作，本課題對(duì)M蛋白在誘導(dǎo)及調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞活化方面做繼續(xù)研究。巨噬細(xì)胞是機(jī)體重要的效應(yīng)細(xì)胞，活化的巨噬細(xì)胞可以分泌促炎癥因子女I：IIL．1p、IL．6、TNF．0【等，這些因子在誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)、抗感染免疫中發(fā)揮著重要作用。炎癥的發(fā)展過程中受許多負(fù)調(diào)控因子的作用，我們對(duì)腫瘤壞死因子13,誘導(dǎo)蛋白3(A20)予以了特別的關(guān)注，A20是炎癥信號(hào)傳導(dǎo)的中心

5、一轉(zhuǎn)錄因子NF．rd3的抑制因子，而M蛋白對(duì)A20的誘導(dǎo)產(chǎn)生，發(fā)揮作用有著怎樣的影響?同時(shí)IL．10是一種強(qiáng)烈的抑制單核巨噬細(xì)胞分泌炎癥因子的細(xì)胞因子，在巨噬細(xì)胞受到M蛋白刺激時(shí)它的表達(dá)情況如何?細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制子(SOCS)是細(xì)胞信號(hào)JAK／STAT通路以及MYD88／NF．r,B通路的負(fù)調(diào)控因子，在M蛋白所致巨噬細(xì)胞炎癥發(fā)展過程中它的表達(dá)量如何?對(duì)于以上疑問，本課題旨在做初步研究。因此，在本研究中我們首先表達(dá)了M蛋白，同時(shí)構(gòu)建并表達(dá)另一種由GAS分泌的蛋I芻SpeB作為對(duì)照蛋白，通過對(duì)比兩種蛋白分別刺激巨噬細(xì)胞后的促炎細(xì)胞因子及相關(guān)負(fù)調(diào)控因子的表達(dá)情況來驗(yàn)證M蛋

6、白是否與其他GAS相關(guān)蛋白在促進(jìn)炎癥以及表達(dá)負(fù)調(diào)控因子方面是否存在差異，以期為今后在M蛋白誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞負(fù)調(diào)控因子表達(dá)方面更深入的研究奠定基礎(chǔ)。通過以上工作，旨在深化對(duì)于GAS的認(rèn)識(shí)，以期為臨床更精確的靶向治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法：1目的蛋白制備：將本室已有的含有M蛋白表達(dá)質(zhì)粒pEGX2．T的貯存菌DH-5a提取質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染表達(dá)菌E．coliBL21，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)M蛋白，經(jīng)SDS．PAGE鑒定后，純化，定量。構(gòu)建SpeB蛋白的表達(dá)質(zhì)粒pET28a．SpeB，中文摘要轉(zhuǎn)染表達(dá)菌E．coliBL21后表達(dá)蛋白，純化，定量。2細(xì)胞毒性試驗(yàn)以及蛋白作用濃度的選擇：首先MTT法檢

7、測(cè)M蛋白和SpeB蛋白的細(xì)胞毒性，鱟試劑盒檢測(cè)融合蛋白LPS含量，然后參考以0．1、1、5、10}tg／ml濃度的M蛋白作用于巨噬細(xì)胞RAW264．7后A20的表達(dá)情況，以確定適合刺激濃度。3以PBS為陰性對(duì)照，以LPS為陽性對(duì)照(用量10ng／91)，M蛋酐[1SpeB蛋白分別刺激RAW264．7細(xì)胞后細(xì)胞因子的表達(dá)：以1099／ml濃度的M蛋白和SpeB蛋白分別刺激RAW264．7細(xì)胞2、4、8、12d,時(shí)后行Realtime—PCR檢測(cè)細(xì)胞因子IL．1p、IL．6、TNF一儀以及負(fù)調(diào)控因子A20、IL．10、NOeSl和ISOCS3