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1、碩士學(xué)位論文論文題目自噬在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的作用：調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞BAFF的表達(dá)研究生姓名李百慧指導(dǎo)教師姓名熊思東專業(yè)名稱免疫學(xué)研究方向自身免疫病論文提交日期2013年6月自噬在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的作用：調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞BAFF的表達(dá)中文摘要中文摘要目的：探討自噬在SLE發(fā)病中的作用。方法：首先對系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）病人外周血淋巴細(xì)胞（PBMC）中自噬相關(guān)基因的mRNA水平進(jìn)行檢測，對自噬是否參與SLE的發(fā)病進(jìn)行初步評價(jià)。其次用活化淋巴細(xì)胞來源DNA（ALD-DNA）采用皮下多點(diǎn)注射方
2、法隔周免疫6-8周齡BALB/c小鼠，三次免疫后檢測血清anti-dsDNA抗體水平和小鼠尿蛋白水平，對小鼠腎臟做病理切片H&E染色，以及檢測腎臟免疫復(fù)合物沉積，判斷SLE小鼠模型是否成功建立。對SLE小鼠外周血淋巴細(xì)胞中自噬相關(guān)基因的mRNA水平進(jìn)行檢測。而后在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE小鼠模型中用Beclin1-shRNA下調(diào)自噬，通過對小鼠anti-dsDNA抗體、尿蛋白、腎臟病理的檢測，判斷SLE病情是否得到改善。選擇巨噬細(xì)胞為研究對象，用WesternBlot對SLE小鼠腎臟和脾臟巨噬細(xì)胞進(jìn)行自噬
3、標(biāo)志分子LC3進(jìn)行檢測。進(jìn)一步在體外以巨噬細(xì)胞系RAW264.7為研究對象，確定ALD-DNA刺激下巨噬細(xì)胞中自噬的發(fā)生：WesternBlot檢測LC3變化；用GFP-LC3質(zhì)粒轉(zhuǎn)染RAW264.7，再用ALD-DNA刺激，檢測GFP-LC3的胞內(nèi)定位情況。進(jìn)而利用3-MA抑制自噬，檢測巨噬細(xì)胞功能：用Griess法測NO含量檢測巨噬細(xì)胞NO分泌情況、流式細(xì)胞術(shù)檢測CD80和CD86分子為標(biāo)志的巨噬細(xì)胞活化情況，ELISA和Real-TimePCR檢測SLE相關(guān)細(xì)胞因子，包括IL-6，IL-8，TNF-α
4、，IL-10，IL-1β，TGF-β和BAFF表達(dá)水平的改變。通過FITC微球吞噬檢測在自噬發(fā)生與抑制情況下巨噬細(xì)胞吞噬能力的改變。最后，我們針對BAFF如何受到自噬的調(diào)控進(jìn)行探討，通過WesternBlot檢測與BAFF相關(guān)的信號通路，確定自噬調(diào)控BAFF的途徑。結(jié)果：SLE病人PBMC中atg5的mRNA水平約高于正常人36倍，beclin1的mRNA水平約高于正常人5倍，lc3b的mRNA水平約高于正常人45倍。在ALD-DNA三次免疫后，小鼠anti-dsDNA抗體水平和尿蛋白水平升高，腎小球腎炎明
5、顯，腎臟免疫復(fù)合物沉積增多，表明我們成功建立SLE小鼠模型。SLE小鼠PBMC中atg12的mRNA水平約高于正常組45倍，atg5的mRNA水平約高于正常組100倍以上，beclin1的mRNA水平約高于正常組150倍左右。而后，我們在I中文摘要自噬在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的作用：調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞BAFF的表達(dá)ALD-DNA誘導(dǎo)SLE的同時(shí)用Beclin1-shRNA免疫小鼠，發(fā)現(xiàn)具有良好的保護(hù)效果：尿蛋白水平下降，抗核抗體水平下降，以及腎臟病理情況的改善都表明自噬的抑制能緩解ALD-DNA誘導(dǎo)SLE
6、的發(fā)病。Westernblot結(jié)果顯示，在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE小鼠脾臟和腎臟巨噬細(xì)胞中，LC3顯著高于對照組與正常組，即SLE小鼠巨噬細(xì)胞自噬水平顯著高于較對照組。利用巨噬細(xì)胞系RAW264.7進(jìn)行體外研究，證實(shí)ALD-DNA的刺激可以直接誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞自噬水平的升高：WesternBlot顯示ALD-DNA在RAW264.7中上調(diào)LC3，并促使GFP-LC3從彌散分布轉(zhuǎn)變?yōu)辄c(diǎn)狀聚集。ALD-DNA能夠在巨噬細(xì)胞中直接激活自噬這一結(jié)果提示自噬可能在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病中發(fā)揮重要的作用。3-MA
7、抑制自噬后，巨噬細(xì)胞功能發(fā)生顯著改變，其中檢測到CD80、CD86分子表達(dá)水平隨自噬的抑制而下降；NO分泌減少；CD80、CD86分子表達(dá)降低；巨噬細(xì)胞中細(xì)胞因子的變化復(fù)雜：IL-6，IL-8，TNF-α和BAFF在自噬受到抑制后顯著下降；MCP-1表達(dá)上升；IL-10，IL-1β，TGF-β的改變不受影響。最后，我們對自噬調(diào)節(jié)BAFF的表達(dá)調(diào)控進(jìn)行機(jī)制探討，發(fā)現(xiàn)自噬被抑制后，IKKα水平下降，IκB水平升高，NF-κBp65水平下降，因此得出結(jié)論：自噬通過調(diào)節(jié)NF-κBp65信號通路調(diào)節(jié)BAFF的表達(dá)。結(jié)
8、論：自噬在ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病中扮演重要的作用；抑制自噬可以緩解ALD-DNA誘導(dǎo)的SLE發(fā)病。自噬對巨噬細(xì)胞的BAFF表達(dá)及其他功能有顯著調(diào)節(jié)作用，其對于BAFF的表達(dá)調(diào)控主要通過NF-κBp65信號通路。關(guān)鍵詞：自噬；SLE；巨噬細(xì)胞；BAFF；NF-κBp65作者：李百慧指導(dǎo)老師：熊思東II自噬在ALD-DNA誘導(dǎo)SLE發(fā)病中的作用：調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞BAFF的表達(dá)英文摘要Autophagypartic
