產(chǎn)酶芽孢桿菌篩選、鑒定及對(duì)肉雞微生態(tài)效應(yīng)的研究

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1、論文獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文足我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，學(xué)位論文中不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得l玨lJfl農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意?！礁谆苌榧m瑚加關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明本人完全了解l四Jll農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱，可以采用影

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3、性，然后制成活菌制劑觀察其對(duì)肉雞生長(zhǎng)性能、肌肉品質(zhì)、腸道菌群、消化酶活性和免疫功能的影響。結(jié)采如下：1．采用平板培養(yǎng)法對(duì)10株芽孢桿菌產(chǎn)蛋白酶、纖維素酶、淀粉酶活性進(jìn)行初選，然后采用比色法測(cè)定芽孢桿菌發(fā)酵培養(yǎng)液酶活性進(jìn)行復(fù)選。篩選出產(chǎn)酶活性較高的芽孢桿菌Pab02菌株。根據(jù)細(xì)菌的16SrDNA序列兩端的保守性設(shè)計(jì)通用引物，提取菌株的基因組DNA，對(duì)菌株的16SrDNA的進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并列擴(kuò)增得到的目標(biāo)片段進(jìn)行測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與NCBI上己知菌種的16SrDNA序列進(jìn)行同源性比較和構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹進(jìn)行分析，結(jié)合細(xì)菌形態(tài)特征、生理生化特性

4、，最終確定芽孢桿菌Pab02為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)。2．為了評(píng)價(jià)該菌的安全性，選用72只昆明系雄性小鼠，隨機(jī)分成6組。藥物對(duì)照組，每只小鼠按20mg／kg體重經(jīng)口灌喂環(huán)磷酰胺，1次／d，連續(xù)5d，誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生生殖毒性；藥物對(duì)照組和空白對(duì)照組小鼠飼喂不舍任何益生菌和抗生素的日糧，芽孢桿菌I組、II組、III組和Ⅳ組分別飼喂含有10’，100，107CFU／g和108CFU／g的飼料。飼喂至30d時(shí)，每組隨機(jī)剖殺6只，檢測(cè)小鼠睪丸、附睪重，精子畸形、精子活力，睪丸組織中MDA含量和SOD活性，精子頂體酶活力，血清睪

5、酮(T)含量，并通過組織切片觀察雄性小鼠睪丸的組織結(jié)構(gòu)。結(jié)果濕示，芽孢桿菌Pab02對(duì)小鼠體重、小鼠睪丸和附睪重均有明顯的增重效果；芽孢桿菌Pab02可提高小鼠精子活率，對(duì)精子畸形的減少?zèng)]有明顯的作用；芽孢桿菌Pab02可降低小鼠睪丸組織中MDA含量，提高睪丸組織中SOD活性、精子頂體酶活力和Jfn．清睪酮的含量，芽孢桿菌Pab02對(duì)小鼠的睪丸組織結(jié)構(gòu)有一定的改善作用。結(jié)果表明，芽孢桿菌Pab02對(duì)雄性小鼠是安全的，沒有造成生殖毒性，對(duì)雄性小鼠生殖功能有一定的促進(jìn)作用。3．芽孢桿菌Pab02菌：懸液按2ml／kg體重(109CFU／m1)

6、灌喂28口齡的肉雞，2次／d，連續(xù)3d后，收集腸道內(nèi)容物，采用RT-qPCR檢測(cè)腸道內(nèi)容物中芽孢柑：菌的數(shù)量。結(jié)果，對(duì)照組(灌喂等量的PBS液)肉雞腸道內(nèi)芽孢桿菌數(shù)住5．37"一6．10log潘膝成(2009)產(chǎn)酶芽他t-t‘菌的篩選、鑒定及對(duì)肉雞的微，：態(tài)效應(yīng)研究Copies／g之間，當(dāng)連續(xù)口服芽孢桿菌Pab02菌懸液后，十-3旨腸內(nèi)的芽孢桿菌數(shù)量從12h到第4d顯著高丁二對(duì)照組，第5d后恢復(fù)到對(duì)照組水平；空腸、回腸和直腸從12h到第5d顯著高于對(duì)照組，第6d后恢復(fù)到對(duì)照組水平。盲腸內(nèi)的芽孢桿菌數(shù)量在36h和60h時(shí)顯著高于對(duì)照組。結(jié)果

7、表明，芽孢桿菌在對(duì)照組肉雞腸道中的數(shù)量較少，芽孢桿菌Pab02作為微生態(tài)制劑鍘喂動(dòng)物，須長(zhǎng)期投服或問斷時(shí)間不超過3d。4．芽孢桿菌Pab02菌懸液連續(xù)灌喂28口齡肉仔雞3d后(2次／d)，收集停喂3d的腸道內(nèi)容物，采用ERIC，PCR／PCR．DGGE方法分析電泳指紋圖譜條帶數(shù)及相似性指數(shù)，以及對(duì)DGGE特異性條帶回收、測(cè)序分析其腸道菌群。結(jié)果顯示，兩種方法都證明肉雞口服芽孢桿菌Pab02后各腸段的條j蒂數(shù)及特征性條帶均明顯多于對(duì)照組，說明芽孢桿菌Pab02具有提高肉雞腸道菌群多樣性和種群密度；通過對(duì)電泳指紋圖譜條帶的聚類分析，兩種檢測(cè)方

8、法顯示肉雞腸道藺群結(jié)構(gòu)的多樣性變化規(guī)律相似，兩組肉雞腸道細(xì)菌之間存在著種群的差異性，但兩組之間腸道總菌群的相似性系數(shù)為53．2％，存在著較高的相似性，說明該年齡段的肉雞腸道微生物種群存在著一定