豬瘟兔化弱毒st傳代細(xì)胞源疫苗效檢替代方法和豬瘟病毒鑒別檢測(cè)方法的建立

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1、獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，進(jìn)行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開發(fā)表或者沒(méi)有公開發(fā)表的作品的內(nèi)容，也不包含為獲得中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。對(duì)本論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：璃乞a。，弓年口6月D窘日關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完全了解中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中監(jiān)所有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁

2、盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議)研究生簽名：珀瓠時(shí)間：0。，弓年o‘月蚶日導(dǎo)師簽名：／三歹面乏量／時(shí)間：加，3年伊f月。g目＼J摘要豬瘟(classicalswinefever，CSF)是由豬瘟病毒(classicalswinefevervirus，CSFV)引起的高度接觸性、多系統(tǒng)出血性豬傳染病。我國(guó)對(duì)于豬瘟的防控主要以豬瘟兔化弱毒疫苗大規(guī)模免疫為主。但是點(diǎn)狀散發(fā)的豬瘟疫情仍時(shí)有

3、發(fā)生，并且在我國(guó)分布廣泛，流行態(tài)勢(shì)日趨復(fù)雜。在這種情況下需要對(duì)疫苗免疫和野毒感染動(dòng)物進(jìn)行鑒別檢測(cè)，調(diào)查豬場(chǎng)巾豬瘟隱性感染或持續(xù)性感染的情況，同時(shí)通過(guò)一定的方法提高豬瘟兔化弱毒疫苗的質(zhì)量。術(shù)研究旨在建立豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗的效檢替代方法以及對(duì)豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和牛病毒性腹瀉病毒的鑒別檢測(cè)方法，為我國(guó)豬瘟的防控工作提供幫助。(1)以兔體定型熱法進(jìn)行豬瘟疫苗效檢受試驗(yàn)兔個(gè)體差異和飼養(yǎng)環(huán)境的影響很人。本研究將待檢疫苗系列稀釋后接種易感細(xì)胞，使用RT-nestPCR、RT-PCR和抗原捕獲ELISA三種方法檢測(cè)細(xì)胞感染后產(chǎn)生的子代病毒。不同疫苗

4、所能夠檢測(cè)到的陽(yáng)性稀釋度的高低可以反映疫苗中的有感染性病毒粒子的濃度，以最高陽(yáng)性稀釋度作為疫苗效價(jià)的指標(biāo)。使用該方法對(duì)12批豬瘟兔化弱毒ST傳代細(xì)胞源疫苗和3批豬瘟兔化弱毒牛睪丸疫苗進(jìn)行效檢并與兔體定型熱法效檢的結(jié)果進(jìn)行比對(duì)。結(jié)果表明，ST傳代細(xì)胞源疫苗的陽(yáng)性稀釋度達(dá)到IO～～I(xiàn)O～，每頭份含2．6×104～3．O×104RID。牛睪丸疫苗的陽(yáng)性稀釋度!lO’4，每頭份含7．0×103～8．O×103RID，本方法效檢的結(jié)果與兔體定型熱法存在一定的相關(guān)性，并且能夠反映疫苗中有感染性病毒粒子的多少。(2)在豬瘟兔化弱毒基因組3’端12nt多聚T堿基插

5、入?yún)^(qū)域兩側(cè)的保守區(qū)域內(nèi)分別設(shè)計(jì)一對(duì)外圍引物和一對(duì)內(nèi)麗引物。豬瘟兔化弱毒的擴(kuò)增片段因包含有多聚T堿基插入片段所以要長(zhǎng)于豬瘟野毒的擴(kuò)增片段。RT-nestPCR方法對(duì)于豬瘟兔化弱毒C株和豬瘟石門毒的檢測(cè)極限分別為0．032pg和0．045pg病毒RNA。特異性試驗(yàn)的檢測(cè)結(jié)果顯示，該方法能夠有效檢測(cè)各類型的豬瘟病毒，對(duì)非豬瘟的其它病原的檢測(cè)結(jié)果均為陰性。對(duì)400份健康豬扁桃體臨床樣本進(jìn)行檢測(cè)得到4份豬瘟兔化弱毒和12份豬瘟野毒陽(yáng)性樣本。對(duì)14批豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測(cè)表明所有疫苗均可檢測(cè)到豬瘟兔化弱毒并且未發(fā)現(xiàn)存在豬瘟野毒污染。所建立的RT-nestPCR

6、鑒別檢測(cè)方法能夠有效區(qū)分豬瘟兔化弱毒和豬瘟野毒，特異性好、靈敏度高。(3)通過(guò)對(duì)47條豬瘟病毒、7條牛病毒性腹瀉病毒和3條邊界病毒基因組全序列比對(duì)，分別在豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和BVDV基因組保守區(qū)域設(shè)計(jì)了3條TaqMan．MGB探針和配套引物。采用正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)上、下游引物濃度、探針濃度以及退火溫度進(jìn)行優(yōu)化。特異性試驗(yàn)表明該方法在同時(shí)鑒別檢測(cè)豬瘟兔化弱毒、不同基因型的豬瘟野毒和BVDV時(shí)均能在相應(yīng)熒光通道觀察到特異性擴(kuò)增曲線，各通道間無(wú)熒光干擾，對(duì)其它病毒的檢測(cè)則無(wú)擴(kuò)增曲線。重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示組間和組內(nèi)變異系數(shù)均不大于1％。敏感性試驗(yàn)表明該方法對(duì)

7、豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒Shimen株、BVDV株的檢測(cè)極限分別為31．拷、1拷貝mL、32．5拷貝。對(duì)份臨床組_Oregon4貝．／rtL5．8／laL400織樣本檢測(cè)得到4份豬瘟兔化弱毒陽(yáng)性、12份豬瘟野毒陽(yáng)性、22份BVDV陽(yáng)性，對(duì)14批商品化豬瘟兔化弱毒疫苗的檢測(cè)表明均能檢測(cè)到豬瘟兔化弱毒，并且無(wú)豬瘟野毒和BVDV污染，與其它檢測(cè)方法的符合率達(dá)到95％以上。本方法可以同時(shí)定量檢測(cè)和區(qū)分豬瘟兔化弱毒、豬瘟野毒和BVDV，可以用于區(qū)分野毒感染和疫苗免疫動(dòng)物，同時(shí)還可以對(duì)豬瘟疫苗的質(zhì)量進(jìn)行監(jiān)控。(4)為了對(duì)我國(guó)種豬場(chǎng)內(nèi)豬瘟病毒的隱性感染情況進(jìn)行了調(diào)

8、查。對(duì)采集自中國(guó)北方部分地區(qū)種豬場(chǎng)臨t{I國(guó)獸醫(yī)藥ruI監(jiān)察所碩：t學(xué)位論文{ijj要床健康豬的400份扁桃體進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)