非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗sop之豬瘟活疫苗檢測

《非禽源細胞及其制品外源病毒檢驗sop之豬瘟活疫苗檢測》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。

1、非禽源制品外源病毒檢驗SOP之豬瘟活疫苗檢測一、目的用于規(guī)范豬瘟活疫苗的外源病毒檢驗。二、適用范圍適用于豬瘟活疫苗制品的外源病毒檢驗。三、檢驗1.注意事項1.1檢驗所用原材料應(yīng)符合有關(guān)規(guī)定。如所選細胞應(yīng)純凈無污染。1.2熒光染色檢查法使用直接免疫熒光抗體檢測和間接免疫熒光抗體檢測均可，直接免疫法是直接用FITC標記的單特異性抗體熒光檢測，間接免疫法是用單特異性抗體和FITC標記的二抗進行熒光檢測直接。該SOP介紹直接熒光操作法。1.3嚴格無菌操作，防止交叉污染。2.儀器設(shè)備與試劑及物品準備2.1儀器設(shè)備恒溫培養(yǎng)箱、CO2培養(yǎng)箱、低速離心機、

2、普通顯微鏡、熒光顯微鏡、水浴鍋等。2.2試劑0.25％EDTA胰酶溶液、MEM營養(yǎng)液、PBS（PH7.2）、PPV熒光多抗、BVDV熒光多抗（北京蘭伯瑞生物技術(shù)有限公司）、滅活胎牛血清、雙抗（100ug/ml）、0.2％豚鼠紅細胞懸液、0.2％雞紅細胞懸液、吉姆薩染色劑等。2.3陽性對照用毒種牛病毒性腹瀉病毒/粘膜病病毒（BVDV）：OregonC24V（美國）、NADL株（美國）或其它毒株；（現(xiàn)用毒株為OregonC24V）豬細小病毒（PPV）：NADL-2株、7909株或其它毒株；(現(xiàn)用毒株BJ-2株)2.4培養(yǎng)液：生長液為含5-10％

3、新生牛血清，維持液為含2-3％新生牛血清。3.檢驗步驟3.1復(fù)蘇Vero、MDBK、PK15（或ST）細胞，經(jīng)傳代1-2次培養(yǎng)，細胞生長良好，均勻鋪成單層，即可用。3.2樣品處理每批樣品取2-3瓶。將樣品混合稀釋至1ml疫苗應(yīng)至少含10頭份。兔源產(chǎn)品由于保護劑和組織的影響，可以5000-8000r/min10min離心取上清接種細胞，細胞源可以直接接種細胞。3.3接種細胞：取處理好的樣品至少10頭份/ml，接種已長好的Vero、MDBK、PK15（或ST）各一瓶，置37℃吸附1小時，吸附后加維持液置5％CO237℃培養(yǎng)（如果樣品保護劑濃度仍

4、高可能影響細胞生長，可棄去液，涮一次，再加維持液培養(yǎng)）。另設(shè)至少1瓶正常細胞對照。3.4樣品的培養(yǎng)和繼代3.4.1細胞培養(yǎng)3-5天后，將上述每種細胞培養(yǎng)物反復(fù)凍融3次后接種于新的相應(yīng)細胞單層用于繼代，同時留樣為1代；再次培養(yǎng)3-5天同樣接種與留樣為2代；最后一次繼代培養(yǎng)5-7天后，接種到新的相應(yīng)細胞單層48孔板中（同步接種），每個樣品重復(fù)8孔，接種量為0.5ml。同時留樣為3代。每次繼代均設(shè)正常細胞對照。培養(yǎng)期間至少繼代1次，待檢樣品在每種細胞上的總培養(yǎng)時間應(yīng)不少于14日。最后一次繼代的細胞單層數(shù)量和面積、培養(yǎng)時間應(yīng)符合熒光抗體檢查法、細胞

5、病變檢查法和紅細胞吸附性外源病毒檢驗的要求。（總接種面積不小于6.0cm2）3.4.2培養(yǎng)期觀察培養(yǎng)期間，對細胞培養(yǎng)物進行常規(guī)檢查，如培養(yǎng)物出現(xiàn)非疫苗病毒引起的細胞病變時，則判為不符合規(guī)定；如無細胞病變，培養(yǎng)結(jié)束時，細胞單層應(yīng)按下述方法繼續(xù)檢驗。4.檢驗方法4.1熒光抗體檢查法4.1.1所檢外源病毒與所用細胞：需要檢查：BVDV，細胞為Vero和MDBKPPV，細胞為PK15或ST4.1.2步驟對每一種特定外源病毒的檢驗應(yīng)包含三組細胞：①被檢樣品最后一次繼代細胞培養(yǎng)物；②被檢樣品最后一次繼代時（及同步接樣時）設(shè)立的特定病毒陽性對照，接種量為

6、100-300FAID50③正常細胞對照。以上培養(yǎng)5-7日后，棄去營養(yǎng)液，用PBS洗滌2-3次，晾干后用80％冷丙酮置2-8℃固定30分鐘，棄去固定液，自然干燥后用相應(yīng)的熒光多抗進行染色、鏡檢。直接免疫熒光檢查法：將針對所檢外源病毒的FITC標記的單特異性抗體（PPV、BVDV熒光多抗）稀釋到工作濃度，滴加（50-100ul/孔）到上述固定好的細胞單層上，37℃作用30-60分鐘，PBS洗滌3次，最后在熒光顯微鏡下觀察染色情況。判定：當陽性對照出現(xiàn)特異熒光，正常細胞無熒光時，如果被檢樣品出現(xiàn)熒光，判為不合格。如果陽性對照熒光不明顯，或陰性對

7、照出現(xiàn)熒光，判為無結(jié)果，應(yīng)重檢。4.2致細胞病變檢查法4.2.1細胞的選擇Vero和PK15（或ST）4.2.2步驟被檢樣品在上述細胞中培養(yǎng)，最后一次繼代的總接種面積不小于6cm2，同時設(shè)立正常細胞對照。用吉姆薩染色液對細胞單層進行常規(guī)染色，觀察包涵體、巨細胞或其他外源病毒引起的CPE。4.2.3判定如出現(xiàn)外源病毒所致的特異性CPE，判為不合格；如果疑有外源病毒污染，又不能通過其他試驗排除這種可能性時，則判為不合格。4.3紅細胞吸附性外源病毒檢驗4.3.1細胞的選擇Vero和PK15或ST4.3.2步驟被檢樣品在上述細胞中培養(yǎng)，最后一次繼代

8、的總接種面積不小于6cm2，同時設(shè)立正常細胞對照。棄去營養(yǎng)液，用PBS洗滌細胞2-3次。加入適量紅細胞懸液（0.2％的豚鼠紅細胞和0.2％雞紅細胞等量混合），以覆蓋整個單層表面為