蟠桃磷脂酶d基因克隆及功能分析

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1、獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導師指導下進行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得新疆農(nóng)業(yè)大學或其他教育單位的學位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。研究生簽名：時間：年月日關于學位論文使用授權的說明本人完全了解新疆農(nóng)業(yè)大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：新疆農(nóng)業(yè)大學有權保留并向國家有關部門或機構送交論文的復印件和電子文檔，可以采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編學位論文，

2、允許論文被查閱和借閱。本人授權新疆農(nóng)業(yè)大學將學位論文的全部或部分內容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索，可以公布（包括刊登）論文的全部或部分內容。(保密的學位論文在解密后應遵守此協(xié)議)研究生簽名：時間：年月日導師簽名：時間：年月日本文是國家自然科學基金項目“新疆蟠桃果實采后品質調控中磷脂酶D作用機理的研究”霍英東教育基金項目“新疆蟠桃磷脂酶D基因的克隆與功能分析”的部分研究成果（項目編號：30860171、121109）課題主持人：袁海英副教授（新疆農(nóng)業(yè)大學）蟠桃磷脂酶D基因的克隆及功能分析摘要蟠桃是典型的躍變型果實，采收后極易腐爛變質，不耐儲藏，其果實采后保

3、鮮是生產(chǎn)實踐中亟待解決的一個難題。李銀等在前期研究中發(fā)現(xiàn)磷脂酶D（PLD）抑制劑處理有利于“英格爾”蟠桃（PrunuspersicaL.Bastchcv.?Yingger?）采后品質的保持。為了進一步深入了解PLD在蟠桃果實發(fā)育及采后儲存中的作用，本研究從篩選優(yōu)化提取蟠桃果實總RNA入手，對蟠桃磷脂酶D基因進行克隆、研究磷脂酶D基因在果實不同發(fā)育階段、不同處理條件下的表達模式，并構建RNAi表達載體遺傳轉化草本果樹草莓，主要研究結果如下：（1）以盛花后100天的蟠桃果實為材料，通過篩選發(fā)現(xiàn)改良CTAB法是適合蟠桃果肉總RNA提取的方法。根據(jù)桃的保守

4、序列設計引物，以蟠桃果實cDNA為模板，利用RT-PCR技術擴增得到1097bp的片段，與GeneBank中發(fā)表的桃的PLD基因進行多重比較，同源性達到99.36%，確定該片段為蟠桃PLD基因的片段。（2）以114bp的蟠桃PLD的cDNA片段為探針，通過Northernblot分析蟠桃果實PLDα基因在果實生長發(fā)育期間和低溫貯藏期間不同處理下的mRNA的表達模式發(fā)現(xiàn)：隨果實發(fā)育成熟磷脂酶D基因的表達逐漸增強，尤其在果實發(fā)育的后期；磷脂酶D抑制劑處理蟠桃果實在一定程度上降低了果實內部磷脂酶D基因的表達活性。（3）根據(jù)蟠桃PLD的cDNA序列，通過R

5、T-PCR擴增約347bp的保守片段，將目標片段插入到pSK-int中間表達載體中,獲得pSK-PLD-RNAi中間表達載體，然后將其轉入植物雙元表達載體pCAMBI1301中，構建該基因的shRNAi表達載體pCAMBIA-PLD-RNAi。經(jīng)限制性內切酶酶切和測序鑒定證明蟠桃磷脂酶D基因的RNAi表達載體pCAMBIA-PLD-RNAi構建成功。（4）利用農(nóng)桿菌介導法轉化草莓(FragariaananassaDuch.)，經(jīng)Km選擇壓初步篩選出5株轉基因草莓植株。對獲得的抗性植株進行PCR擴增，獲得4株陽性植株，初步表明目的基因已插入到草莓基因

6、組中。關鍵詞：蟠桃；PLD；Northernblot；RNAi表達載體；遺傳轉化ICloningandFunctionAnalysisofPhospholipaseDGeneinFlatPeachFruitAbstractFlatPeachfruit(PrunuspersicaL.Batsch)isatypicalclimactericfruitanditreachesmaturityinshorttimeafterharvestandthengetsrotteneasily.Therefore,howtoextenditsshelftimebec

7、omesaurgentproblemthatneedtobesolved.PreviousresearchofLietalfoundthatphospholipaseD(PLD)inhibitortreatmenthelpedqualitymaintenanceofflatpeachfruitsafterharvest.TofurtherinvestigatethefunctionofPLDinfruitdevelopmentandpostharveststorageofflatpeachfruit,weselectedandoptimizedth

8、etotalRNAextractionmethod,clonedPLDfromflatpeachfruit,underto