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《遼寧地區(qū)歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法建立與流行情況調查》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、分類號：S855.3單位代碼：10183研究生學號：201185Z003密級：公開吉林大學博士學位論文遼寧地區(qū)歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法建立及流行情況調查EstablishmentofdiagnosticmethodandPrevalenceSurveyofEuropeanPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeinLiaoningProvince作者姓名：李冰專業(yè)：獸醫(yī)博士研究方向：獸醫(yī)技術服務指導教師：丁壯教授培養(yǎng)單位：動物醫(yī)學學院2015年12月遼寧地區(qū)歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法建立與流行情況調查Establishm
2、entofdiagnosticmethodandPrevalenceSurveyofEuropeanPorcineReproductiveandRespiratorySyndromeinLiaoningProvince作者姓名：李冰專業(yè)名稱：獸醫(yī)博士研究方向：獸醫(yī)技術服務指導教師：丁壯教授學位類別：獸醫(yī)博士培養(yǎng)單位：動物醫(yī)學學院論文答辯日期：2015年12月4日授予學位日期：年月日論文評閱人：答辯委員會組成：姓名職稱工作單位姓名職稱工作單位盲審專家正高級華中農業(yè)大學主席：王洪斌教授東北農業(yè)大學盲審專家正高級廣西大學委員：錢愛東教授吉林農業(yè)大學盲審專家正高級西北農林科技大學張西
3、臣教授吉林大學盲審專家正高級中國農業(yè)科學院張乃生教授吉林大學盲審專家正高級東北林業(yè)大學高豐教授吉林大學李建華教授吉林大學馮海華教授吉林大學吉林大學博士(或碩士)學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交學位論文，是本人在指導教師的指導下，獨立進行研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內容外，本論文不包含任何其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的作品成果。對本文的研究做出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人完全意識到本聲明的法律結果由本人承擔。學位論文作者簽名：日期：2015年12月4日中文摘要遼寧地區(qū)歐洲型豬繁殖與呼吸綜合征診斷方法建立及流行情況調查豬繁殖與呼吸綜合
4、征在世界各地廣泛流行，對養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。近年來國內豬群中不斷檢測到歐洲型PRRSV，而且歐洲型毒株感染有上升趨勢。歐洲型病毒株的感染不但可以引起豬只死亡，也能引起免疫抑制，同時還影響高致病性豬藍耳病的防控工作。本論文以自然發(fā)病病例為基礎，從病原學、病理學和分子生物學等多方面進行診斷方法的研究，并對分離毒株進行全基因測序，分析遺傳變異特點，在此基礎上建立PRRSV多重PCR鑒別診斷方法及間接ELISA檢測方法，對遼寧地區(qū)開展歐洲型PRRSV流行情況調查，分析了發(fā)病原因并提出防控建議。用Marc-145細胞從疑似PRRS仔豬病料中分離到一株病毒，經(jīng)電鏡觀察、中和試驗、
5、PCR鑒定和基因序列分析確定為歐洲型PRRSV（命名為LNEU12）；通過仔豬感染試驗對歐洲型PRRS的臨診表現(xiàn)、病理變化特點和病毒抗原在組織分布情況進行了全面的研究，初步建立了歐洲型PRRS的診斷方法，并證實遼寧地區(qū)存在歐洲型PRRSV。采用RT-PCR方法對遼寧分離株LNEU12的全基因序列進行分段擴增，并進行了序列分析。LNEU12毒株基因全長15083bp（不含尾部），GenBank登陸號為KM196101（已公布）。LNEU12毒株有8個開放閱讀框，與國內外14株歐洲型PRRSV的核苷酸同源性為83.7%～93.0%，其中與歐洲型標準毒株LV同源性為90.1%，而與
6、美洲型標準毒株VR2332株同源性僅為59.6%。與歐洲型標準毒株LV比較缺失了18個核苷酸，在NSP2氨基酸的358～359和409位點分別缺失了4個和1個氨基酸，在ORF3、ORF4基因重疊區(qū)域缺失了3個堿基。針對歐洲型毒株ORF7和美洲型毒株NSP2基因序列用Oligo7.0軟件設計2對特異性引物建立了多重PCR檢測方法，該方法可以特異性擴增出歐洲型毒株、美洲型經(jīng)典毒株和變異毒株的目的基因，片段大小差異在90bp以上便于電泳觀察，重組質粒標準品檢測下限為1.93×103拷貝。用重疊延伸PCR將歐洲型PRRSVN蛋白特異性線性抗原A、C位點的基因進行重復串聯(lián)，合成186b
7、p的DNA基因片段。采用原核表達系統(tǒng)將串聯(lián)基因序列高效表達，獲得32.8kD的重組蛋白（含GST標簽），經(jīng)Western-blot檢測，該重組蛋白能與歐洲型PRRS陽性血清發(fā)生免疫反應，并且具有較高的特異性。用純化后的重組蛋白包被酶標板，建立了特異性檢測歐洲型PRRSV抗體的間接ELISA方法，該方法可以有效區(qū)別美洲型、歐洲型毒株的中和抗體。I用建立的間接ELISA方法對遼寧地區(qū)歐洲型PRRSV進行血清學調查，結果顯示個體抗體陽性率為0.51%，豬場抗體陽性率為4.55%；用多重PCR方法對57個豬場2
