基于核酸適配體的赭曲霉毒素a和伏馬毒素b_1檢測方法研究

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1、分類號—密級不保密ＵＰＣ５７７碩±學(xué)位論文基于核酸適配體的髓曲霉毒素Ａ和伏馬毒素Ｂｉ檢測方法研究作者姓名；桂海變指導(dǎo)教師；宋厚輝研究員學(xué)科專業(yè)名稱；動(dòng)物學(xué)研巧方向：動(dòng)物疾病防控所在學(xué)院；農(nóng)業(yè)與食品科學(xué)學(xué)院、動(dòng)物科技學(xué)院論文提交日期：２０１５年６月８日浙江農(nóng)林大學(xué)２０１５年６月８日ZhejiangA&FUniversityDissertationfortheDegreeofMasterDevelopmentoftheAptame

2、r-basedMethodfortheDetectionofOchratoxinAandFumonisinB1Candidate:GUIHai-luanAdviser:SONGHou-hui,ProfessorSpeciality:ZoologyDateofSubmission:June,2015ZhejiangA&FUniversityLin’an,ZhejiangProvince,P.R.ChinaJune,2015獨(dú)創(chuàng)性聲明（２０１２ＡＡ１０１６０）項(xiàng)目資助，本人聲明，所呈交的學(xué)位論文，

3、是受國家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃，，在指導(dǎo)教師指導(dǎo)下，通過我的努力取得的成果并且是自己撰寫的。盡我所知除了文中作了，也標(biāo)注和致謝中己經(jīng)作了答謝的地方外，論文中不包含其他人發(fā)表或撰寫過的研究成果不包一含在浙江農(nóng)林大學(xué)或其他教育機(jī)構(gòu)獲得學(xué)位或證書而使用過的材料。與我同對本研究做出貢謝意，。如被查有嚴(yán)重侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為獻(xiàn)的同志，都在論文中作了明確的說明并表示了由本人承擔(dān)應(yīng)有的責(zé)任。學(xué)位論文作者親筆簽名日期：皆塵圣全＾句論文使用授權(quán)的說明本人完全了解浙江農(nóng)林大學(xué)有關(guān)保留，、使用學(xué)位

4、論文的規(guī)定即學(xué)校有權(quán)送交論文的復(fù)?。崳姡蓿炯?，允許論文被查閱和借閱；學(xué)?？桑薰颊撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容可；＾采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。，在年后解密可適用本授權(quán)書。□保密＾不保密，本學(xué)位論文屬于不保密。□＂＂（請?jiān)诜娇騼?nèi)打Ｖ）巳一批ｙｊ《少Ｉ三學(xué)位論文作者親筆簽名日期：ｐ勻、ｔ：曰期ｐ指導(dǎo)教師親筆簽名：ｙ；仁摘要摘要霉菌毒素是由真菌產(chǎn)生的一種具有毒性的代謝產(chǎn)物。赭曲霉毒素A（OTA）是存在于谷物、飼料等農(nóng)產(chǎn)品中的一種霉菌毒素，而伏馬毒素B1（FB1

5、）是主要存在于玉米及玉米制品中的一種致癌物。因此，霉菌毒素精準(zhǔn)檢測技術(shù)的開發(fā)對于保障食品安全至關(guān)重要。為此本文基于特異性核酸適配體建立OTA和FB1的檢測方法。核酸適配體是一種特異性識別靶分子的單鏈寡核苷酸（RNA或DNA），具有較強(qiáng)的親和力。PicoGreen是一種可以定量檢測雙鏈DNA且不受單鏈DNA影響的熒光染料，在激發(fā)波長480nm處有最大熒光。為了開發(fā)針對霉菌毒素的快速檢測技術(shù)，本研究利用核酸適配體及PicoGreen染料的特點(diǎn)，建立了一種基于核酸適配體快速檢測赭曲霉毒素A和檢測伏馬毒素B1

6、的方法。結(jié)果表明本研究建立的PicoGreen/適配體方法的最優(yōu)反應(yīng)緩沖體系為：10mmol/LTris，120mmol/LNaCl，5mmol/LKCl，20mmol/LCaCl2（pH8.5）。本研究使用的OTA核酸適配體序列為：5'-GATCGGGTGTGGGTGGCGTAAAGGGAGCATCGGACAA-3'。該核酸適配體與OTA結(jié)合后，未結(jié)合的核酸適配體與互補(bǔ)鏈雜交生成雙鏈DNA，PicoGreen與雙鏈DNA反應(yīng)3min后激發(fā)產(chǎn)生的熒光達(dá)到峰值（激發(fā)波長為480nm，發(fā)射波長為520nm

7、）。該方法檢測赭曲霉毒素A的靈敏度為：1μg/L；檢測范圍為：1μg/L?200μg/L。OTA核酸適配體與黃曲霉毒素B1、伏馬毒素、桔毒素和玉米赤霉烯酮等霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。本方法與基于抗體的ELISA方法符合（Kappa值為：0.885）。本研究利用FB1核酸適配體和PicoGreen建立檢測FB1的方法，最低檢測限為0.1μg/L，線性范圍為0.1μg/L?1μg/L。整個(gè)檢測流程可在45min內(nèi)完成。特異性試驗(yàn)表明，適配體方法特異性強(qiáng)，與靶標(biāo)霉菌毒素以外的常見霉菌毒素?zé)o交叉反應(yīng)。結(jié)果表明適配體

8、方法與商品化的基于抗體的ELISA方法非常符合（Kappa值0.857）。由于核酸適配體比抗體成本低，檢測時(shí)間短，本研究建立的基于核酸適配體的方法比ELISA方法更具有市場競爭性和推廣應(yīng)用價(jià)值。關(guān)鍵詞：赭曲霉毒素A，伏馬毒素B1，核酸適配體，熒光染料，快速檢測。IABSTRACTABSTRACTMycotoxinisatoxicmetaboliteproducedbyorganismsoffungi.OchratoxinA(OTA)isamycotoxi