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《家蠶體內(nèi)活性氧代謝及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)：Q965學(xué)校代碼：10712UDC：595.7研究生學(xué)號(hào)：2010060052密級(jí)：公開(kāi)2015屆攻讀博士學(xué)位研究生學(xué)位（畢業(yè)）論文家蠶體內(nèi)活性氧代謝及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控學(xué)科專業(yè)農(nóng)業(yè)昆蟲(chóng)與害蟲(chóng)防治研究方向：昆蟲(chóng)生化與分子生物學(xué)研究生張磊指導(dǎo)教師：呂志強(qiáng)教授完成時(shí)間：2015年5月中國(guó)陜西楊凌Classificationcode:_Q965_Universitycode:10712UDC:595.7Postgraduatenumber:2010060052Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorth
2、westA＆FUniversityin_2015_REACTIVEOXYGENSPECIESMETABOLISMANDREGULATIONOFRELATEDGENESINTHESILKWORM,BOMBYXMORIMajor:AgriculturalEntomologyandPestControlResearchfield:InsectphysiologyandbiochemistryNameofPostgraduate:LeiZhangAdviser:Prof.ZhiqiangLuDateofsubmission:May2015YanglingShaanxiChina項(xiàng)目資
3、助本研究得到國(guó)家自然科學(xué)基金資助（31272497）ThisworkwasfinanciallysupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChina(no.31272497).家蠶體內(nèi)活性氧及相關(guān)基因表達(dá)調(diào)控摘要自然界中，病原微生物主要通過(guò)食物傳播進(jìn)入宿主體內(nèi)。昆蟲(chóng)通過(guò)取食感染細(xì)菌后，腸道是抵御外界病原物的第一重要防線。腸道免疫主要通過(guò)腸道上皮細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（Reactiveoxygenspecies,ROS）及抗菌肽（Antimicrobialpeptide,AMP）來(lái)防御病原菌浸染。家蠶作為重要的模式昆蟲(chóng)，也具有重要的
4、經(jīng)濟(jì)價(jià)值，研究家蠶免疫機(jī)制及抗病機(jī)理對(duì)于建立病原-微生物模型建立及蠶病的防治具有重要意義。本研究中我們利用革蘭氏陽(yáng)性菌（金黃色葡萄球菌Staphylococcusaureus,S.a；黑胸?cái)⊙鶥acillusbombyseptieus,B.b；藤黃微球菌Micrococcusluteus,M.l及肺炎鏈球菌Streptococcuspneumonia,S.p）及革蘭氏陰性菌（綠膿桿菌Pseudomonasaeruginosa,P.a；粘質(zhì)沙雷氏菌Serratiamarcescens,S.m及鼠疫耶爾森菌Yersiniapseudotuberculosis,YPIII）通過(guò)喂
5、食及注射兩種方式感染家蠶，統(tǒng)計(jì)家蠶死亡率，然后檢測(cè)家蠶腸道及血淋巴中的H2O2濃度變化，并通過(guò)半定量PCR及熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)了中腸組織中活性氧代謝相關(guān)基因及抗菌肽基因的轉(zhuǎn)錄變化情況。隨后我們利用原核表達(dá)得到了家蠶過(guò)氧化物酶5（BombyxmoriPeroxiredoxin5）的重組蛋白并對(duì)其進(jìn)行了體外活性檢測(cè)，并同樣利用定量PCR檢測(cè)了細(xì)菌感染后BmPrx5在中腸，脂肪體及血細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄變化情況。主要結(jié)果如下：(1)通過(guò)細(xì)菌注射感染結(jié)果證明，革蘭氏陰性菌（S.m及P.a）對(duì)家蠶的平均致死率高于革蘭氏陽(yáng)性菌（S.a及M.l）。喂食S.m后中腸活性氧代謝相關(guān)基因上調(diào)最為明顯
6、,所有生成ROS的基因的變化倍數(shù)低于分解ROS基因的變化，導(dǎo)致感染后腸道H2O2水平一直低于對(duì)照。(2)通過(guò)細(xì)菌喂食感染家蠶證明家蠶致病菌黑胸?cái)⊙˙.b）比綠膿桿菌（P.a）具有更強(qiáng)的致病性，喂食感后8h可誘導(dǎo)家蠶腸道內(nèi)H2O2水平顯著升高，當(dāng)感染時(shí)間增加，進(jìn)入到血腔中的細(xì)菌同樣引起血淋巴中活性氧水平的顯著升高。通過(guò)熒光實(shí)時(shí)定量PCR研究ROS代謝相關(guān)基因的表達(dá)變化，結(jié)果顯示P.a感染后8h可誘導(dǎo)腸道內(nèi)雙氧化酶（Duox）及過(guò)氧化氫酶（CAT）的轉(zhuǎn)錄上調(diào)，而感染后16h，P.a可誘導(dǎo)一氧化氮（NO）合成關(guān)鍵基因（一氧化氮核酶2，NOS2）的上調(diào)表達(dá)，喂食細(xì)菌感染同樣可以誘
7、導(dǎo)家蠶中腸抗菌肽基因的上調(diào)表達(dá)，而抗菌肽Glovorin2及Glovorin3在感染初期轉(zhuǎn)錄上調(diào)最為明顯。進(jìn)一步證明ROS、NO及AMP的產(chǎn)生在家蠶腸道免疫防御中的重要作用。(3)我們克隆了家蠶過(guò)氧化物酶5（BmPrx5）基因的cDNA序列，基因ORF全長(zhǎng)565bp，編碼188個(gè)氨基酸殘基。序列分析結(jié)果顯示BmPrx5含有兩個(gè)Cys（Cys48及Cys152）屬于atypical2-Cys過(guò)氧化物酶家族。通過(guò)原核表達(dá)及純化得到重組蛋白BmPrx5，體外活性檢測(cè)顯示BmPrx5具有降解H2O2及保護(hù)DNA
