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《檢測(cè)水貂阿留申病dot-elisa方法的建立及初步驗(yàn)證》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、分類號(hào)：S858.92單位代碼：10193密級(jí)：無(wú)學(xué)號(hào)：2012715碩士學(xué)位論文檢測(cè)水貂阿留申病Dot-ELISA方法的建立及初步驗(yàn)證EstablishmentandpreliminaryverificationofDot-ELISAdetectionMethodofAleutianDiseaseofMink作者姓名：李晶學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向：經(jīng)濟(jì)動(dòng)物疫病學(xué)指導(dǎo)教師：杜銳所在學(xué)院：動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院2015年6月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的成果。盡
2、我所知，除文中特別加以標(biāo)注和致謝所列內(nèi)容外，論文中不包含其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過(guò)的研究成果，也不包含為獲得吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過(guò)的材料。與我一同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均已在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。本學(xué)位論文所有內(nèi)容若有不實(shí)之處，本人愿意承擔(dān)一切相關(guān)法律責(zé)任和后果。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日關(guān)于論文使用授權(quán)的聲明1、本人完全了解吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留和使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學(xué)位期間所完成的論文及相關(guān)成果的知識(shí)產(chǎn)權(quán)屬吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)所有，并同意將本論文的版權(quán)授權(quán)
3、給吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)，學(xué)校有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。2、本人（同意/不同意，務(wù)必打印后填寫）吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)將本論文版權(quán)授權(quán)給不同媒體進(jìn)行電子出版、多媒體出版、網(wǎng)絡(luò)出版以及其他形式出版（涉密學(xué)位論文解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）。3、本人聲明畢業(yè)后若發(fā)表在攻讀研究生學(xué)位期間完成的論文及相關(guān)的學(xué)術(shù)成果，必須以吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)作為第一署名單位。學(xué)位論文作者簽名：簽字日期：年月日導(dǎo)師簽名：簽字日期：年月日摘要水貂阿留申?。ˋleutiandiseaseofmink，AD）是
4、由水貂阿留申病毒（Aleutiandiseasevirus，ADV）引起的一種持續(xù)性病毒性傳染病。ADV感染幼貂后可引發(fā)嚴(yán)重的急性間質(zhì)性肺炎，死亡率極高；而成年水貂感染ADV后則會(huì)形成持久性感染，癥狀表現(xiàn)為腎小球腎炎，漿細(xì)胞增多，高丙種球蛋白血癥，動(dòng)脈炎，生殖性能減退和自發(fā)性流產(chǎn)，給全球的水貂養(yǎng)殖業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。由于該病致病機(jī)理特殊，至今未研制出有效的疫苗制劑，只能通過(guò)多種診斷方法篩選和淘汰病貂，達(dá)到根除疾病的目的。雖然該病的診斷方法較多，但大多數(shù)都不適合基層單位使用，即使是應(yīng)用最廣的對(duì)流免疫電泳（CIEP）法，也因
5、其耗時(shí)長(zhǎng)和易散毒的缺點(diǎn)，限制了其在基層的推廣應(yīng)用。目前迫切需要建立一種更為安全簡(jiǎn)便，且能廣泛應(yīng)用于基層單位的診斷方法。Dot-ELISA方法除了具有常規(guī)ELISA的優(yōu)點(diǎn)外，還具有用量少，操作簡(jiǎn)便，不需要任何儀器、成本低廉，結(jié)果易判斷且能長(zhǎng)期保存等優(yōu)點(diǎn)，非常適用于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。本試驗(yàn)應(yīng)用PCR技術(shù)從ADV-G中擴(kuò)增出VP2全長(zhǎng)基因和VP2截短基因；通過(guò)重疊延伸剪接技術(shù)將VP2截短基因與本實(shí)驗(yàn)室已驗(yàn)證的，具有良好反應(yīng)原性的兩段NS1截短基因（NS1-2和NS1-3）進(jìn)行融合，獲得兩段融合基因SPb和SPc；將VP2全長(zhǎng)基因、VP2截
6、短基因以及兩段融合基因SPb和SPc分別與克隆載體pMD18-T連接，構(gòu)建重組克隆質(zhì)粒并對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR、酶切及測(cè)序鑒定；將鑒定后的重組克隆質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切，并與原核表達(dá)載體pGEX-4T-1連接，構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，進(jìn)行PCR鑒定、酶切鑒定和測(cè)序；將鑒定后的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21，探索目的蛋白的最優(yōu)表達(dá)條件，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行SDS-PAGE和Westernblot分析；SDS-PAGE結(jié)果顯示4段表達(dá)蛋白均與預(yù)期大小相符，Westernblot結(jié)果顯示每段蛋白均能被貂抗ADV陽(yáng)性血請(qǐng)識(shí)別，具有良好反應(yīng)原性；分別
7、對(duì)表達(dá)的4段蛋白和NS1全基因蛋白、NS1-2蛋白、NS1-3蛋白（實(shí)驗(yàn)室之前構(gòu)建的NS1截短表達(dá)蛋白）進(jìn)行純化，再以7種純化蛋白作為包被抗原分別建立Dot-ELISA方法；將所建立的Dot-ELISA方法與CIEP進(jìn)行對(duì)比。通過(guò)對(duì)比分析可知，各抗原的Dot-ELISA方法敏感性均高于CIEP，而與其它抗原相比，融合抗原SPc作為包被抗原所建立的Dot-ELISA方法敏感性高，特異性強(qiáng)。關(guān)鍵詞：水貂阿留申病，VP2基因，NS1基因，原核表達(dá)，Dot-ELISAIAbstractAleutiandisease（AD）isape
8、rsistentviralinfectiousdiseasecausedbyAleutiandiseasevirus(ADV).ADVinfectioninneonatalminkkitscausesacute,rapidlyprogressinginterstitialpneumonia
