水貂阿留申病乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用

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1、：Ｓ８５８．９２０１８３分類(lèi)號(hào)單位代碼：１研究生學(xué)號(hào)：２０１５８５４０１０密級(jí)：公開(kāi)吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文專(zhuān)業(yè)學(xué)位（）水貂阿留申病乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎａｎｄＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＬａｔｅｘＡｌｕｔｉｎａｔｉｏｎｔｅｓｔｆｏｒＤｅｔｅｃｔｉｏｎｇｇｏｏｆＡｎｔｉｂｏｄａａｉｎｓｔＡｌｅｕｔｉａｎＭｉｎｋＤｉｓｅａｓｅｙｇ作者姓名：孫殿鋼類(lèi)別：獸醫(yī)碩士領(lǐng)域‘（方向）：獸醫(yī)指導(dǎo)教師：雷連成教授培養(yǎng)單位：動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院２０１８年

2、０６月水貂阿留申病乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用PreparationandApplicationofLatexAgglutinationtestforDetectionofAntibodyagainstAleutianMinkDisease作者姓名：孫殿鋼領(lǐng)域（方向）：獸醫(yī)指導(dǎo)教師：雷連成教授類(lèi)別：獸醫(yī)碩士答辯日期：2018年6月2日未經(jīng)本論文作者的書(shū)面授權(quán)，依法收存和保管本論文書(shū)面版本、電子版本的任何單位和個(gè)人，均不得對(duì)本論文的全部或部分內(nèi)容進(jìn)行任何形式的復(fù)制、修改、發(fā)行、出租、改編等有礙作者著作權(quán)的商業(yè)性

3、使用（但純學(xué)術(shù)性使用不在此限）。否則，應(yīng)承擔(dān)侵權(quán)的法律責(zé)任。吉林大學(xué)碩士學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交學(xué)位論文，是本人在指導(dǎo)教師的指導(dǎo)下，獨(dú)立進(jìn)行研宄工作所取得的成果Ｄ除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的作品成果。對(duì)本文的研宄做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明。本人完全意識(shí)到本聲明的法律結(jié)果由本人承擔(dān)。如Ｍ學(xué)位論文作者簽名：★日期：山Ｗ年６月／日丨中文摘要水貂阿留申病乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)方法的建立及應(yīng)用水貂阿留申?。ˋleuti

4、andiseaseofmink,AD），由阿留申病毒（Aleutiandiseasevirus,ADV）引起的進(jìn)行性傳染病。該病不僅能夠?qū)е迈跞旱姆敝衬芰ο陆?，而且還能引起成年水貂消瘦、皮張質(zhì)量降低等問(wèn)題，使特種養(yǎng)殖行業(yè)承受了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重阻礙了我國(guó)毛皮行業(yè)的健康發(fā)展。目前公認(rèn)的辦法是通過(guò)檢測(cè)來(lái)逐步淘汰病貂、弱貂，以達(dá)到凈化貂群的作用。ADV特異性抗體檢測(cè)是診斷該病的最有效途徑，對(duì)流免疫電泳技術(shù)（Convectionimmuneelectrophoresis,CIEP）是ADV血清抗體檢測(cè)方法之一，但該方法操作過(guò)程比較繁瑣，檢

5、測(cè)時(shí)間相對(duì)較長(zhǎng)，加之需要特定儀器設(shè)備，在臨床應(yīng)用上受到了一定的阻礙。因此，建立一種準(zhǔn)確率高、省時(shí)高效的水貂阿留申病檢測(cè)方法勢(shì)在必行。本研究將實(shí)驗(yàn)室前期設(shè)計(jì)并串聯(lián)表達(dá)的水貂阿留申病毒抗原表位（簡(jiǎn)稱(chēng)抗原肽-SD）與羧基化聚苯乙烯微球共價(jià)偶聯(lián)，制備抗原肽-SD微球復(fù)合物，建立了檢測(cè)水貂阿留申病血清中特異性抗體的乳膠微球凝集試驗(yàn)方法。結(jié)果表明，制備抗原肽-SD微球復(fù)合物的最佳條件為：羧基化聚苯乙烯微球以EDC為活化劑、活化時(shí)間為15min、pH7.5MES緩沖液反應(yīng)體系、偶聯(lián)時(shí)間為30min，蛋白濃度為0.4mg/ml。制備的抗原肽-SD微

6、球復(fù)合物為檢測(cè)抗原，建立的水貂阿留申病乳膠凝集試驗(yàn)抗體檢測(cè)操作方法為：分別將被檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清稀釋2倍，滴加20?l于載玻片上，同時(shí)做平行對(duì)照；將20?l抗原肽-SD微球復(fù)合物滴加到待檢血清和標(biāo)準(zhǔn)陰、陽(yáng)性血清對(duì)照上，混勻后靜置30s~60s觀察結(jié)果。結(jié)果表明，該復(fù)合物可與ADV陽(yáng)性血清出現(xiàn)較強(qiáng)的凝集反應(yīng)，與偽狂犬病毒、犬瘟熱病毒和水貂腸炎病毒等陽(yáng)性血清均無(wú)凝集反應(yīng)，具有良好的特異性。在1:32稀釋的陽(yáng)性血清與抗原肽-SD復(fù)合物仍能產(chǎn)生微弱的凝集反應(yīng)，表明該方法具有良好的敏感性；該復(fù)合物與ADV陰性血清、蒸餾水、MES緩沖液、

7、PBS等無(wú)凝集反應(yīng)，不發(fā)生自凝現(xiàn)象。I根據(jù)本試驗(yàn)所建立的方法，初步研制了便于現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)ADV抗體的乳膠微球凝集試劑盒，與CIEP同步檢測(cè)本實(shí)驗(yàn)室保存的404份水貂血清樣品，結(jié)果表明，二者的符合率為89.6%。2017年10月，用該試劑盒在打皮期間對(duì)大連市瓦房店市的三家水貂養(yǎng)殖場(chǎng)（A場(chǎng)、B場(chǎng)、C場(chǎng)）的373份血清進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明，三個(gè)場(chǎng)的總陽(yáng)性感染率分別為：67.85%、66.93%和66.42%。隨后，又對(duì)該試劑盒進(jìn)行了中間試制，結(jié)果表明，該試劑盒在特異性、敏感性和重復(fù)性上表現(xiàn)均良好。綜上所述，本研究建立的抗原肽-SD微球凝集方法以

8、及組裝的試劑盒，檢測(cè)時(shí)間短，敏感性和特異性均良好，與CIEP的符合率較高，檢測(cè)結(jié)果不需要復(fù)雜處理，為基層貂群提供了一種快速診斷方法，值得推廣，也可為更好地預(yù)防和控制AD提供技術(shù)保障。關(guān)鍵詞：水貂阿留申病，微球，凝集試驗(yàn)，抗體檢測(cè)，血清