茯苓遺傳多樣性和轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究

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3、使用過的材料。對本文的研究做出重要貢獻的個人或集體均已在文中作了明確的說明并表示謝意。本人完全意識到本聲明的法律責(zé)任和法律后果由本人承擔(dān)。簽論文作者簽名：或）、巧＾字日期：ｘ＞／文年《月５＾日論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解武漢輕工大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定進，特授權(quán)武漢輕工大學(xué)可Ｗ將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫行檢索，并采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存、匯編，ＵＵ共查閱和借閱。同意學(xué)校向國家有關(guān)部口或機構(gòu)送交論文的復(fù)本和電子文件。論（保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)說明）簽文作者簽名：導(dǎo)師簽名：字日期：＞＾１（

4、年＾月５日簽字日期：月日＾（分類號密級UDC學(xué)校代碼10496碩士學(xué)位論文茯苓遺傳多樣性和轉(zhuǎn)化技術(shù)的研究GeneticdiversityandtransformationtechnologyresearchofWolfiporiacocos論文作者孫巧指導(dǎo)教師陳平教授學(xué)科專業(yè)藥物化學(xué)論文提交日期論文答辯日期答辯委員會主席評閱人2015年6月摘要茯苓Wolfiporiacocos是我國傳統(tǒng)的藥食兼用的中藥材，在中國已有2000多年的藥用歷史。目前我國茯苓藥材主要依靠人工種植，存在的主要問題是菌種質(zhì)量參次不齊及菌種老化，嚴重制約了茯苓的規(guī)?；N植。本課題選取茯苓主產(chǎn)區(qū)的22個菌株，運用

5、現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)及方法對茯苓的遺傳多樣性和轉(zhuǎn)化技術(shù)開展了系統(tǒng)的研究，利用菌落形態(tài)及生長速度等生物學(xué)性狀和ISSR標記技術(shù)分析了茯苓的遺傳多樣性，并建立了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體茯苓轉(zhuǎn)化體系，為茯苓種質(zhì)資源的利用及高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)菌種的選育工作奠定了研究基礎(chǔ)。研究結(jié)果如下：1、實驗結(jié)果表明，在同一培養(yǎng)基下，不同產(chǎn)區(qū)的茯苓菌株的菌落形態(tài)及生長速度有所區(qū)別。碳、氮源試驗表明茯苓的生長對其營養(yǎng)條件要求較高，對碳、氮源有選擇偏好性。在高滲逆境條件下茯苓會分泌一種褐色素，會引起菌種退化。栽培環(huán)境、營養(yǎng)條件是影響茯苓的生物學(xué)特性主要因素。2、篩選出17條擴增穩(wěn)定、條帶清晰的ISSR引物，共擴增出多態(tài)性條帶562

6、條，占總帶數(shù)81.9%；等位基因(Na)的變化范圍為1.00~2.00，有效等位基因(Ne)的平均值為1.40；Nei基因多樣性(H)為0.25，Shannon信息指數(shù)(I)為0.42。表明栽培茯苓資源的遺傳多樣性豐富。3、生物學(xué)特性和ISSR聚類結(jié)果表明，位于我國大別山區(qū)的茯苓菌株為一類，其遺傳背景較為單一。來自云南騰沖、大理等地的菌株與湖北英山菌株為一類，聚類結(jié)果與種植環(huán)境及地理分布等因素?zé)o關(guān)，可能是受人為活動的影響。4、構(gòu)建了帶有篩選標記潮霉素的重組載體Pgpd-hph-TtrpC3300，經(jīng)PEG介導(dǎo)轉(zhuǎn)入到原生質(zhì)體中，成功實現(xiàn)了對茯苓菌株的轉(zhuǎn)化，同時建立了茯苓遺傳轉(zhuǎn)化平臺，對于茯

7、苓優(yōu)良菌株的篩選和保存具有重要的意義。5、篩選出了能夠穩(wěn)定表達潮霉素抗性的轉(zhuǎn)化菌株，繼代培養(yǎng)5代后仍有潮霉素的抗性，說明該方法得到的轉(zhuǎn)化子具有遺傳穩(wěn)定性。PCR和Southernblot結(jié)果表明：所得到的轉(zhuǎn)化子均擴增到目的片段，外源DNA已經(jīng)插入到茯苓基因組中，為單拷貝。隨著茯苓傳代而穩(wěn)定的遺傳。驗證了PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體的轉(zhuǎn)化系統(tǒng)對真菌遺傳轉(zhuǎn)化的可行性。I6、轉(zhuǎn)化子菌株在含潮霉素的PDA中培養(yǎng)，其菌落形態(tài)和生長速度均未發(fā)生明顯變化