產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的不同重組片段的免疫原性比較

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1、論文編號(hào)：82110-2012-04中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學(xué)位論文產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌毒素的不同重組片段的免疫原性比較ComparisonoftheImmunogenicityofRecombinantFragmentsofToxigenicPasteurellaMultocidaToxin研究生：王猛指導(dǎo)教師：蔣玉文研究員申請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)研究方向：獸醫(yī)微生物與免疫學(xué)學(xué)位授予單位：中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所2015年5月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人鄭敢聲明：所呈交的學(xué)位論文，是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下，進(jìn)行

2、研究工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本學(xué)位論文的研究成果不包含任何他人創(chuàng)作的、已公開發(fā)表或者沒有公開發(fā)表的作品的內(nèi)容，也不包含為獲得中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所或其它教育機(jī)構(gòu)的孕位或證書而使爪過的材料。對(duì)木論文所涉及的研究工作做出貢獻(xiàn)的其他個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明的法律責(zé)任由本人承擔(dān)。學(xué)位論文作者簽名：i&K年6月丨7曰關(guān)于論文使用授權(quán)旳說明木人完全了解中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所有乂保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：中監(jiān)所有權(quán)保留送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱，

3、可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所可以用不同方式在不同媒體上發(fā)表、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)谷。(保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此協(xié)議）研究生簽名：L時(shí)間:us年6月丨"/円導(dǎo)師簽名：時(shí)間:年円中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所碩士學(xué)位論文摘要摘要+產(chǎn)毒多殺性巴氏桿菌(toxigenicPasteurellamultocida,TPm)是引起豬進(jìn)行性萎縮性鼻炎(progressiveatrophicrhinitis,PAR)的主要致病菌。該病是以面部變形、鼻部扭曲、鼻衄為主要特

4、征的呼吸道傳染病，流行十分廣泛。病豬生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率降低，給養(yǎng)豬業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)+損失。疫苗免疫是預(yù)防和控制該病的主要有效措施。TPm分泌的皮膚壞死毒素（Pasteurellamultocidatoxin，PMT）是引起PAR最主要的致病因子。PMT是一個(gè)弱免疫原，但當(dāng)其自然結(jié)構(gòu)被破壞后，其免疫原性會(huì)增強(qiáng)。部分截短PMT片段被預(yù)測(cè)為很好的抗原。+本研究根據(jù)GenBank中已發(fā)表的PMT基因（toxA）序列，設(shè)計(jì)引物，以TPmHN-06株基因組DNA為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得PMT完整基因，并成功構(gòu)建克

5、隆質(zhì)粒pMD18-T-PMT。根據(jù)DNAStar軟件預(yù)測(cè)分析獲得的PMT親水性基團(tuán)分布的生物信息，結(jié)合相關(guān)的研究報(bào)道，選取8個(gè)不同PMT截短片段作為免疫原性研究的對(duì)象。以質(zhì)粒pMD18-T-PMT為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增獲得8個(gè)截短PMT片段基因，并分別克隆至原核表達(dá)載體pET-32a（+）系統(tǒng)中。PCR鑒定、雙酶切鑒定和序列測(cè)定結(jié)果表明，8個(gè)重組PMT片段表達(dá)載體均構(gòu)建成功。以IPTG為誘導(dǎo)劑，分別對(duì)8個(gè)重組表達(dá)菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE結(jié)果表明，8個(gè)重組PMT片段均成功獲得表達(dá)，且以包涵體形式表

6、達(dá)為主。Western-blotting結(jié)果表明，僅重組PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa片段與PMT抗血清有明顯的反應(yīng)原性。小鼠毒性試驗(yàn)表明，該4個(gè)重組PMT片段均不致死小鼠。對(duì)反應(yīng)原性較好的3個(gè)PMT片段進(jìn)行條件優(yōu)化，以提高其表達(dá)量。將PMT1-506aa、PMT1-391aa、PMT505-1285aa和PMT973-1285aa4個(gè)重組PMT片段分別制備疫苗，皮下注射免疫小鼠，間隔14d進(jìn)行二免。二免后14d，用天然PMT進(jìn)行皮下

7、注射攻毒。結(jié)果以2MLD進(jìn)行攻毒時(shí)，PMT1-506aa（10/10）、PMT505-1285aa（10/10）和PMT973-1285aa（8/10）免疫保護(hù)效果顯著優(yōu)于PMT1-391aa（1/10）；以5MLD進(jìn)行攻毒時(shí)，PMT1-506aa（10/10）和PMT505-1285aa（10/10）免疫保護(hù)效果顯著優(yōu)于PMT973-1285aa（3/10）和PMT1-391aa（0/10）；進(jìn)一步以10MLD進(jìn)行攻毒時(shí)，PMT505-1285aa（10/10）免疫保護(hù)效果顯著優(yōu)于PMT1-506a

8、a（3/10）。小鼠的免疫保護(hù)試驗(yàn)結(jié)果表明，4個(gè)重組PMT片段中PMT505-1285aa具有較高的免疫保護(hù)率。選取重組PMT505-1285aa片段制備疫苗，肌肉注射免疫斷奶仔豬，間隔14d進(jìn)行二免。二免++10后14d，根據(jù)建立的仔豬感染TPm模型，進(jìn)行TPmHN-06株新鮮菌液（2×10CFU）滴鼻攻毒，30d后剖檢觀察鼻甲骨病變，結(jié)果對(duì)照組5/5發(fā)生鼻甲骨萎縮，免疫組4/5正常，表明該疫苗對(duì)仔豬具有免疫保護(hù)作用。同時(shí)，應(yīng)用建立的iELISA方法，