資源描述：
《牛傳染性鼻氣管炎病毒sh7株gb、gd基因的原核表達(dá)及elisa方法的建立》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。
1、AnhuiAgriculturalUniversityDissertationfortheMasterateProkaryoticExpressionofInfectiousBovineRhinotracheitisVirusSH7IsolateGlycoproteinBandGlycoproteinDandEstablishmentofELISAMethodsCandidate:FeiWeiyanSupervisor:Prof.WangGuijunRrof.ZhangKechunAcademicdegreeappliedfor:MasterofveterinarymedicineSpecia
2、lity:VeterinarymedicineResearchfield:InfectiousdiseasesofdomesticanimalsCollege:AnimalScienceandTechnologyCollegeMay,2015項(xiàng)目基金1.上海市科委上海市產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟項(xiàng)目，上海市優(yōu)質(zhì)原料奶產(chǎn)業(yè)技術(shù)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟（13DZ0510900）摘要牛傳染性鼻氣管炎（InfectiousBovineRhinotracheitis，IBR）是由皰疹病毒科（Herpesviridae）甲皰疹病毒亞科（Alphaherpesvirinae）中的牛傳染性鼻氣管炎病毒（InfectiousBo
3、vineRhinotracheitisVirus,IBRV）引起的牛的一種接觸性傳染病。該病被世界動物衛(wèi)生組織（OIE）列為B類疫病，是我國入境動物及國際動物貿(mào)易的重點(diǎn)檢疫疫病。目前，gB、gD蛋白是IBRV檢測的首選蛋白。本研究從前期分離的IBRVSH7株的gB、gD基因入手，旨在通過與已發(fā)表的國內(nèi)外IBRV經(jīng)典株進(jìn)行比較，確定IBRVSH7株與上述經(jīng)典株的同源關(guān)系。擴(kuò)增出了大小分別為2802bp、1254bp的gB、gD基因序列。在同源性比較中，IBRVSH7株的gB、gD基因序列與瑞士BHVCooper株（GenBank：Z78205.1）的gB、gD基因的同源性均為100%。通過對gB
4、、gD基因序列的分析，擴(kuò)增出了大小分別為1461bp和1005bp的目的片段。將新擴(kuò)增的gB、gD目的基因片段分別克隆至原核表達(dá)載體pColdⅡ和pET-28a中，成功構(gòu)建了原核表達(dá)重組質(zhì)粒pColdⅡ-gB和pET-28a-gD；轉(zhuǎn)入BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞后，用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，Ni柱親和層析純化法對蛋白進(jìn)行純化。SDS-PAGE結(jié)果表明，重組pColdⅡ-gB蛋白以包涵體形式表達(dá)，相對分子質(zhì)量約為55.7kDa；重組pET-28a-gD蛋白以可溶形式表達(dá)，相對分子質(zhì)量約為40.6kDa。純化的重組pColdⅡ-gB蛋白濃度為0.701mg/mL，純化的重組pET-28a-gD蛋白濃度
5、為0.518mg/mL。利用純化的重組蛋白pColdⅡ-gB和重組蛋白pET-28a-gD作為包被抗原建立了三種檢測IBRV抗體的ELISA檢測方法，分別命名為gB-ELISA、gD-ELISA和gB+gD-ELISA。通過對ELISA方法各條件的優(yōu)化試驗(yàn)，確定了gB-ELISA、gD-ELISA最佳抗原包被濃度分別為2.804μg/mL，4.144μg/mL。gB-ELISA、gD-ELISA和gB+gD-ELISA血清稀釋濃度分別為1:80、1:40和1:80；最佳血清反應(yīng)時間為37℃1h；最佳封閉液均為1%BSA；最佳酶標(biāo)二抗?jié)舛葹?:12000、1:15000和1:12000；最佳酶標(biāo)
6、二抗反應(yīng)時間為37℃1h；最佳底物反應(yīng)時間為10min；陰陽性判定臨界值為0.311、0.346和0.292。特異性和重復(fù)性試驗(yàn)表明，三種ELISA方法特異性和重復(fù)性均較好。應(yīng)用三種方法對341份臨床樣品檢測，與瑞典SVANOVAIBR-AbELISA檢測試劑盒相比，符合率分別為93.427%、92.965%和95.673%。本研究分析了IBRVSH7株gB、gD基因的同源性，并建立了三種IBRV抗體的間接ELISA檢測方法，三種方法與國外商品化檢測試劑盒相比，符合率較高，其中g(shù)B+gD-ELISA符合率最高，為進(jìn)一步研制檢測試劑盒提供了新的思路I和技術(shù)支持。關(guān)鍵詞：牛傳染性鼻氣管炎；gB；g
7、D；間接ELISAIIAbstractIBR（InfectiousBovineRhinotracheitis）isancontagiousdiseaseofcowcausedbyIBRV(InfectiousBovineRhinotracheitisVirus),whichbelongstoAlphaherpesvirinae,Herpesviridae.ItislistasBclassdisea
