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《牛傳染性鼻氣管炎病毒gd基因的表達(dá)及elisa診斷方法的建立》由會(huì)員上傳分享,免費(fèi)在線閱讀,更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫(kù)。
1、摘要牛傳染性鼻氣管炎病毒(Infectiousbovinerhinotracheitisvirus,IBRV)可引起牛發(fā)生急性、熱性、接觸性傳染病--牛傳染性鼻氣管炎(Infectiousbovinerhinotracheitis,IBR)。主要表現(xiàn)為呼吸道和生殖道感染。IBRV主要的基因包括gB、gC、gD、gE和TK基因,其中糖蛋白gD位于IBRV囊膜表面,能誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生保護(hù)性抗體的抗原,因此gD可作為鑒別診斷IBR的首選特異性抗原。本試驗(yàn)以IBRV的gD基因?yàn)檠芯繉?duì)象,通過原核表達(dá)蛋白后,用其建立檢測(cè)IBRV抗體的間接E
2、LISA診斷方法,并進(jìn)行初步應(yīng)用,目的是期望在臨床實(shí)踐中能夠快速檢測(cè)和診斷牛傳染性鼻氣管炎病,為今后該病的檢驗(yàn)檢疫和凈化提供技術(shù)支持。本研究主要進(jìn)行了如下兩個(gè)方面的研究工作:一、IBRVgD基因的原核表達(dá)根據(jù)Genbank上發(fā)表的gD基因序列,設(shè)計(jì)合成3對(duì)特異性引物,利用PCR擴(kuò)增出gD基因3段表位即gD-A、gD-B、gD-C,并構(gòu)建原核表達(dá)重組質(zhì)粒pET-28a-gD。將其轉(zhuǎn)入BL21(DE3)表達(dá)菌中,利用IPTG誘導(dǎo)表達(dá)。經(jīng)酶切鑒定及基因測(cè)序均證明原核表達(dá)載體構(gòu)建成功。SDS-PAGE表明,gD融合蛋白主要以包涵體形式
3、在大腸埃希菌中高效表達(dá),成功獲得了大小約為48ku的融合蛋白,與預(yù)期的蛋白分子量一致。純化后的gD重組蛋白濃度為0.128mg/mL,免疫印跡的結(jié)果顯示純化后的gD重組蛋白能與IBR標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性血清發(fā)生特異性反應(yīng),說明其免疫原性良好。二、IBRV抗體間接ELISA方法建立與初步應(yīng)用以純化的IBRVgD蛋白為包被抗原,建立檢測(cè)IBRV抗體的間接ELISA方法。通過對(duì)各種反應(yīng)條件的優(yōu)化,確定最佳包被抗原濃度為6.4μg/mL,包被時(shí)間為4℃過夜,血清稀釋度為1:50,血清反應(yīng)條件為37℃1h,封閉液為5%脫脂乳,HRP-兔抗牛IgG的
4、最佳工作濃度為1:10000,最佳顯色時(shí)間為37℃15min,經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析后確定的陰陽(yáng)性臨界值為0.219。結(jié)果顯示,利用本研究所建立的ELISA方法不但特異性強(qiáng),而且重復(fù)性穩(wěn)定。應(yīng)用本試驗(yàn)所建立檢測(cè)方法和IDEXX試劑盒,分別對(duì)442份來自黑龍江省部分地區(qū)未經(jīng)免疫的牛血清樣本進(jìn)行檢測(cè),結(jié)果顯示在442份血清樣本中102份樣本IBR抗體呈陽(yáng)性,血清陽(yáng)性率為23.1%,與IDEXX試劑盒達(dá)到90.2%的符合率。臨床檢測(cè)結(jié)果顯示,所建立的檢測(cè)方法具有特異、敏感和穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn),應(yīng)用前景廣闊。關(guān)鍵詞:IBRV;gD;原核表達(dá);間接E
5、LISAIAbstractInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBRV)ismainpathogenofInfectiousbovinerhinotracheitisvirus(IBR).IBRVoftencausedsevererespiratoryandgenitaltractinfectionofbovine.GlycoproteingDproteinwaslocatedonthesurfaceofvirusenvelope,whichcanstimulateorganismtoge
6、nerateneutralizingantibody,soitcouldbeusedtodiagnosticreagentforIBRV.Inthepresentstudy,prokaryoticexpressionofIBRVgDgenetoestablishanindirectELISAmethodtodetectantibodiesagainstIBRV,expectingthatitcanfastdiagnoseIBR.Thisstudymainlycontainstworesearches:Apairofprimer
7、swasdesignedaccordingtotheIBRVgDsequencesinGenBanktoamplifythecompleteopenreadingframe.PCRproductofgD,containingthreeepitope:gD-A、gD-B、gD-C,wastheninsertedintointotheprokaryoticexpressionvectorpET-28a-gDrespectively,thentransformtherecombinantplasmidintocompetentcel
8、lsofBL21(DE3).AfterinducedbyIPTG,bothofthemweresuccessfullyexpressedandidentifiedbyrestrictionenzymedigestionandgenesequencing.SDS-PAGEdem