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1、分類號(hào)：?jiǎn)挝淮a：10364密級(jí)：學(xué)號(hào)：12720390安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)位論文洋甘菊EβF合成酶基因的克隆及功能研究Cloningandcharacterizationof(E)-β-farnesenesynthasefromMatricariarecutitaL.研究生：蘇閃閃指導(dǎo)教師：袁藝教授申請(qǐng)學(xué)位門類級(jí)別：理學(xué)碩士專業(yè)名稱：植物學(xué)研究方向：藥用植物的開(kāi)發(fā)與利用所在學(xué)院：生命科學(xué)學(xué)院答辯委員會(huì)主席：2015年6月獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個(gè)人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)巧的研究了作及取得的研究成果。盡我所知．除了義中特別加化標(biāo)巧和致謝的地方外
2、，論義中不包含巧他人己經(jīng)發(fā)表或撰寫(xiě)過(guò)的研究成果，也不包含為獲得安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)一的學(xué)位或證書(shū)術(shù)使用過(guò)的材料。與我同工作的同志對(duì)本研究所做的任何貢獻(xiàn)均ｄ在論文中作了明確的說(shuō)明并表示了謝意。研巧半豁對(duì)時(shí)問(wèn)：＞少年／月／州關(guān)于論文使用授權(quán)的說(shuō)明本人完令了解安徵農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留，：學(xué)校有權(quán)、使用學(xué)化論文的規(guī)定即＾，、保留送交論義的巧印件和磁盤，允許論義被查閱和借閱可斗采用影印縮印或？＾、匯編學(xué)位論文１心用不同方式巧不同掃描等復(fù)制子段保存。同意安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)可媒體上發(fā)表。、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)奔（保密的
3、學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此憤議）＇研化牛／〇．宿名時(shí)間；Ｗ年口ｆ＾３＾。Ｊ時(shí)間１廣；％年占月口第導(dǎo)師簽名；如（摘要洋甘菊(MatricariarecutitaL.)為菊科母菊屬一年生草本植物，含有豐富的倍半萜和類黃酮等化合物，具有良好的抗炎、抑菌、抗氧化、降血脂、抗凝血、抗腫瘤、解痙等功效。(E)-β-法尼烯（EβF）是一種普遍存在于植物內(nèi)的揮發(fā)性倍半萜類物質(zhì)，作為蚜蟲(chóng)報(bào)警信息素的主要成分，參與蚜蟲(chóng)的防御化學(xué)信號(hào)傳遞。為了闡明EβF生物合成的代謝調(diào)控，本研究一方面克隆了洋甘菊(E)-β-法尼烯合酶基因，并研究了該基因的功能；
4、另一方面利用GC-MS技術(shù)檢測(cè)茉莉酸甲酯處理后洋甘菊葉片中揮發(fā)性萜類含量的變化。該研究初步探討了茉莉酸甲酯調(diào)節(jié)洋甘菊萜類次生代謝的規(guī)律，為通過(guò)基因工程手段提高洋甘菊倍半萜含量提供了理論基礎(chǔ)。該研究取得的主要結(jié)果如下：1.利用RT-PCR及RACE技術(shù)克隆了洋甘菊βFS基因的全長(zhǎng)cDNA序列，命名為Mr-βFS。該基因全長(zhǎng)為2010bp，包含一個(gè)1725bp的開(kāi)放閱讀框，編碼579個(gè)氨基酸(GenBank序列號(hào):KM586847)。推測(cè)氨基酸分子量為67kDa，等電點(diǎn)為5.28。洋甘菊βFS的氨基酸序列與青蒿的βFS有較高同源性，同源性為92%，而與
5、其他植物同源性約為20%-40%。進(jìn)化樹(shù)分析結(jié)果表明，Mr-βFS與青蒿親緣關(guān)系最近。2.構(gòu)建了原核表達(dá)質(zhì)粒pET-28a-βFS，并在大腸桿菌BL21(DE3)中表達(dá)了重組蛋白，重組蛋白分子量大小為67kDa。將目的蛋白與底物法尼基焦磷酸(FPP)進(jìn)行反應(yīng)，通過(guò)GC-MS檢測(cè)，表明Mr-βFS催化底物生成唯一的倍半萜成分為(E)-β-法尼烯。3.利用熒光定量PCR檢測(cè)Mr-βFS基因在不同器官中的表達(dá)量。結(jié)果表明，Mr-βFS基因在莖、葉、管狀花、舌狀花中均有表達(dá)，在葉中表達(dá)量最高，管狀花中表達(dá)量最低，葉中表達(dá)量約是管狀花中表達(dá)量的6.8倍。Mr
6、-ΒFS基因在洋甘菊花的全開(kāi)期表達(dá)量最低，在花苞期及半開(kāi)期的表達(dá)量分別是全開(kāi)期的1.6倍和2.6倍。4.利用外源茉莉酸甲酯(MeJA)對(duì)洋甘菊葉片進(jìn)行處理后，Mr-βFS表達(dá)量明顯增加。其中，在處理24h后Mr-βFS表達(dá)水平增加最為顯著，是對(duì)照組的11.5倍。GC-MS分析表明，MeJA誘導(dǎo)后葉片中幾種揮發(fā)性萜類β-羅勒烯、(E)-β-法尼烯、大根香葉烯D、γ-欖香烯、α-法尼烯的含量與對(duì)照相比均存在顯著差異(P<0.05)。關(guān)鍵詞：洋甘菊，EβF合成酶，克隆與表達(dá)，茉莉酸甲酯IAbstractMatricariarecutita(L.)isak
7、indofannualherbfromGenusMatricariainAsteraceae,whichcontainsabundantchemicalcompoundssuchassesquiterpenesandflavonoids,andthereforehassignificantantiinflammatory,antibacterial,anti-oxidation,hypolipidemic,anticoagulation,antineoplasticandspasmolyticproperties.(E)-β-farnesene(E
8、βF)isanimportantsesquiterpenecompoundwidelyexistsinanumberofp
