毛竹萜類合成酶基因tpss的克隆、表達(dá)與功能研究

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1、分類號(hào)Ｑ９４８．１密綴公立ＵＤＣ學(xué)位論文毛竹磅類合成酶基因７７誠的克隆、表達(dá)與功能研究Ｃｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｓｏｂａｍｂｏｏｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ（ＴＰＳｓ）陳香指導(dǎo)教師姓名湯鋒教授￣申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博去￣專業(yè)名稱生態(tài)學(xué)研究方向植物化學(xué)－￣￣論文提交日期２０１５年５月論文答辯日期２０１５年６月—學(xué)位授予日期２０１５年７月答辯委員會(huì)主席張宏巧評(píng)閱人北成？中齒林業(yè)科

2、學(xué)研究院中國蛛《種鋒卻《訟學(xué)位論文毛竹酷類合成酶基因７Ｐ況的克隆、表達(dá)與功能研究學(xué)位論文作者指導(dǎo)教師姓名湯鋒教授指導(dǎo)小組成員岳永德教授王進(jìn)副研究貢孫背支副研究員申請(qǐng)學(xué)位級(jí)別博壬專業(yè)名稱生態(tài)學(xué)研究方向植物化學(xué)論文答辯日期２０１５年６月１９曰中國？北京ＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎｆｏｒｔｈｅＤｅｒｅｅｇＣｌｏｎｉｎｇ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎａｌａｎａｌｙｓｉｓｏｆｍｏｓｏｂａｍｂｏｏｔｅｒｐｅｎｅｓｙｎｔｈａｓｅｇｅｎｅｓ（ＴＰＳｓ）Ｃａｎｄｉｄａ

3、ｔｅ：ＸｉａｎＣｈｅｎｇｕｒｖｒ：ａｎＳｅｉｓｏＦｅｎＴＡｐｇｇｓｓｏｃｉａ化Ｓｕｅｒｖｉｓｏｒ：ＹｏｎｄｅＹｕｅｐｇＪｉｎＷａｎｇｉａＳｕｎＪｃａｅｍｉｃＤｅｒｅｅｌｅｄｏｒ：化．Ｄ．ＡｄＡｉｆｇｐｐＳｅｃｉａｌｉｔ：ＥｃｏｌｏｐｙｇｙＤａｅｏＤｅｅｎｃｅ：ｔｆｆ２０１５．０６．１９－－Ｄｅｒｅｅｃｏｎ化ｒｒｉｎｉｎｔｉｔｕｔｉｎＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｏｆＦｏｒｅｓｔｒｓｏ：ｇｙｙｇ摘要萜類是自然界存在的一類由異戊二烯為結(jié)構(gòu)單元的化合物的總稱，是迄今所發(fā)現(xiàn)的植物次生代謝物中最大的一個(gè)家族

4、，具有多種化學(xué)生態(tài)學(xué)效應(yīng)，如植物花香揮發(fā)物的主要成分之一就是萜烯類化合物，可作為重要的表達(dá)信號(hào)來引誘昆蟲進(jìn)行授粉和受精；同時(shí)當(dāng)植物受到昆蟲侵襲時(shí)，會(huì)釋放大量的揮發(fā)性萜類，用于吸引昆蟲的天敵而使自身免受傷害。此外，萜類化合物在植物與植食性昆蟲以及病原菌互作中發(fā)揮重要作用，直接或間接參與植物的防御反應(yīng)。毛竹（Phyllostachysedulis）是禾本科植物中最具有代表性的林業(yè)資源，也是竹亞科中最具生態(tài)和經(jīng)濟(jì)價(jià)值的物種，同時(shí)由于其分布廣泛、經(jīng)濟(jì)價(jià)值高、加工產(chǎn)品豐富等特點(diǎn)，因而被廣大研究人員作為竹亞科模式植物進(jìn)行研究。毛竹基因組數(shù)據(jù)庫已于2013年完成測(cè)序，但其中大多數(shù)基因

5、的功能尚不清楚，而本文則利用分子生物學(xué)手段旨在從毛竹基因組中分離出萜類合成酶的相關(guān)基因（MoTPS），獲取完整的各基因編碼序列，再分別采用原核表達(dá)和真核表達(dá)系統(tǒng)獲得MoTPS高效表達(dá)的工程菌，然后對(duì)各融合蛋白進(jìn)行分離和純化，并進(jìn)一步鑒定其功能。該項(xiàng)研究對(duì)闡明毛竹萜類代謝途徑及其關(guān)鍵酶的功能具有重要意義，同時(shí)也為萜類的工業(yè)化發(fā)酵生產(chǎn)提供借鑒和改造靶點(diǎn)。本文的主要研究結(jié)果如下：1.基于毛竹基因組數(shù)據(jù)信息，通過KEGG注釋從中篩選出潛在的萜類合成酶基因共15條，命名為MoTPS1-15。通過構(gòu)建進(jìn)化樹分析發(fā)現(xiàn)其中有8條基因（MoTPS1-8）歸屬于Tpsa亞族，負(fù)責(zé)編碼倍半萜

6、和二萜合成酶基因，有4條基因（MoTPS10-12/14）歸屬于Tpsb亞族，負(fù)責(zé)編碼單萜合成酶，MoTPS13屬于Tpsg亞族，而MoTPS9和MoTPS15則不屬于任何已知的萜類合成酶家族。對(duì)這15條基因編碼的蛋白進(jìn)行定位分析，發(fā)現(xiàn)其大多數(shù)存在于胞質(zhì)中，少部分位于葉綠體中，與植物體內(nèi)的兩條萜類生物合成途徑相呼應(yīng)。實(shí)驗(yàn)過程中通過梯度PCR改變退火溫度，并使用不同的毛竹組織樣品為擴(kuò)增模板，成功獲得8條基因的完整序列，分別為MoTPS2/3/5/6/11-14，其中MoTPS12和MoTPS13這2條基因由于可變剪接方式的不同而產(chǎn)生兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本，分別標(biāo)記為MoTPS12S和

7、MoTPS13S。I2.原核表達(dá)體系采用了5種表達(dá)載體，分別為pGEX4T-1、pET30a(+)、pET32a(+)、pET28a-sumo和pColdI-sumo載體，將上述10條基因經(jīng)合適的限制酶處理后分別與載體連接，成功構(gòu)建出pGEX4T-1-MoTPS2/12/12S/13/13S、pET30a-MoTPS2、pET32a-MoTPS2/12/12S/13/13S、pET28a-sumo-MoTPS2/5/6和pColdI-sumo-MoTPS2/5/6/14共18種原核表達(dá)重組質(zhì)粒，隨后將其分別轉(zhuǎn)化到不同的大腸桿菌株系中進(jìn)行表