甜高粱ssadh基因克隆鑒定及耐鹽高粱品種的篩選

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1、西南科技大學(xué)研究生學(xué)位論文甜高粱SSADH基因克隆鑒定及耐鹽高粱品種的篩選年級2012級姓名王龍海申請學(xué)位級別理學(xué)碩士專業(yè)生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)老師朱莉副研究員ClassifiedIndex:U.D.C:SouthwestUniversityofScienceandTechnologyMasterDegreeThesisSweetSorghumSSADHGeneCloneIdentifyandSaltToleranceSorghumSpeciesScreeningGrade:2012Candidate:WangLonghaiAcademicDegreeAppliedfo

2、r:MasterSpeciality:BiochemistryandMolecularBiologySupervisor:AssociateResearchFellowAPR.02,2015獨(dú)創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進(jìn)行的研究工作及取得的研究成果。盡我所知，除了文中特別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得西南科技大學(xué)或其它教育機(jī)構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻(xiàn)均己在論文中作了明確的說明并表示了謝意。關(guān)于論文使用和授權(quán)的說明本人完全了解西南科技大學(xué)有關(guān)保留、使用學(xué)位

3、論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留學(xué)位論文的復(fù)印件，允許該論文被查閱和借閱；學(xué)?？梢怨荚撜撐牡娜炕虿糠謨?nèi)容，可以采用影印、縮印或其他復(fù)制手段保存論文。（保密的學(xué)位論文在解密后應(yīng)遵守此規(guī)定）西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第I頁摘要γ-氨基丁酸（γ-aminobutyricacid,GABA）代謝途徑是TCA循環(huán)的一個代謝旁路途徑，在動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)中發(fā)揮重要作用；而植物中，與植物響應(yīng)各種生物脅迫和非生物脅迫密切相關(guān)。琥珀酸半醛脫氫酶SSADH是GABA途徑的一個關(guān)鍵酶，不可逆性地催化琥珀酸半醛形成琥珀酸，后者進(jìn)入三羧酸循環(huán)。已有的研究表明該基因與植物的生長發(fā)育、逆境脅迫應(yīng)答密

4、切相關(guān)。甜高粱是一種重要的生物能源作物，具有多種抗逆特性，因此克隆并鑒定這些優(yōu)良的抗逆基因?qū)τ谧魑锏倪z傳育種改良具有重要意義。但是SSADH在甜高粱抗逆性中所起的作用，目前尚不清楚。本研究首次從甜高粱中克隆獲得了SSADH基因的編碼區(qū)序列；并對其進(jìn)行了原核表達(dá)和酶活測定、亞細(xì)胞定位分析，同時利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法進(jìn)行高粱幼胚遺傳轉(zhuǎn)化，創(chuàng)建基因過表達(dá)株系等方面進(jìn)行了研究。為今后深入研究SSADH基因與甜高粱抗性的關(guān)系提供重要依據(jù)。主要結(jié)果如下：1、利用RT-PCR技術(shù)首次從甜高粱Keller中克隆到了SSADH基因編碼區(qū)序列。該序列全長1584bp，編碼527個氨基酸，分子量大約

5、是52.45KD；基因結(jié)構(gòu)與功能在線分析顯示基因具有琥珀酸半醛脫氫酶活性結(jié)構(gòu)域，和一個24個氨基酸的信號肽；與已知物種的SSADH基因編碼區(qū)序列比對發(fā)現(xiàn)，序列相似度較高，僅信號肽部分差異較大。2、構(gòu)建兩個原核表達(dá)載體：一個全長的表達(dá)載體pET-28a-SSADH（1584）和截掉信號肽的原核表達(dá)載體pET-28a-SSADH（1386），僅pET-28a-SSADH(1386)表達(dá)出了SSADH蛋白；通過Ni-瓊脂糖凝膠層析柱純化出目的蛋白；并測出了蛋白的酶活，結(jié)果表明蛋白具有琥珀酸半醛脫氫酶的酶活，測得酶活為0.042units/mg蛋白；同時研究發(fā)現(xiàn)加入SSADH酶的

6、抑制劑AMP和ATP后，酶活被抑制。3、構(gòu)建SSADH基因序列與GFP報告基因的融合表達(dá)載體，利用煙草葉片瞬時表達(dá)系統(tǒng)進(jìn)行亞細(xì)胞定位分析，激光共聚焦顯微鏡（CLSM）分析結(jié)果表明，SSADH定位于線粒體中，與SSADH基因的功能預(yù)測相吻合。qRT-PCR分析了6個品種甜高粱的幼葉SSADH基因的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)基因的表達(dá)差異不大。4、本實(shí)驗(yàn)通過構(gòu)建甜高粱SSADH基因的過表達(dá)載體pH7WG2D-SSADH，并西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第II頁以農(nóng)桿菌侵染法，轉(zhuǎn)化高粱BTX-SKU的愈傷組織，以潮霉素作為篩選劑，潮霉素篩選壓50mg/ml、75mg/ml、100mg/ml

7、依次增加，經(jīng)過三輪篩選，獲得SSADH基因的抗性愈傷；抗性愈傷已經(jīng)進(jìn)入再生培養(yǎng)和生根培養(yǎng)。5、實(shí)驗(yàn)通過0mM、100mM、200mM三個濃度梯度的NaCl處理11個不同的高粱種子；統(tǒng)計10天的發(fā)芽情況，并10天后收獲幼苗、測量幼苗根重、根長、苗重和苗長分析高粱的耐鹽性。篩選得到一個相對耐鹽品種泰斯和一個鹽敏感的品種10-80。以上研究結(jié)果為更進(jìn)一步的研究甜高粱SSADH基因在甜高粱抗性特性中的具體功能和甜高粱育種奠定了一定的基礎(chǔ)。關(guān)鍵詞：甜高粱琥珀酸半醛脫氫酶原核表達(dá)亞細(xì)胞定位遺傳轉(zhuǎn)化西南科技大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文第III頁A