馬氏珠母貝血清抗菌活性蛋白的分離純化與鑒定

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1、分類號(hào):5917.4密級(jí)：公開(kāi)UDC?639.4學(xué)號(hào)：2111201130戶瘃海洋太摩碩士學(xué)位論文馬氏珠母貝血清抗菌活性蛋白的分離純化與鑒定朱家萍指導(dǎo)教師：梁海鷹教授串請(qǐng)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士專業(yè)名稱：水產(chǎn)養(yǎng)殖研究方向：水產(chǎn)無(wú)脊椎動(dòng)物增養(yǎng)殖與珍珠培育學(xué)院名稱：水產(chǎn)學(xué)院中國(guó)?湛江2015年6月學(xué)位論文答辯委員會(huì)組成主席：委員：導(dǎo)師：時(shí)間：廣東海洋大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨(dú)立進(jìn)行研究所取得的研究成果。除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文不包含任何其他個(gè)人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對(duì)本文的研究做出重要貢獻(xiàn)的個(gè)人和集體，均已在文中以明確方式標(biāo)明。本人

2、完全意識(shí)到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國(guó)家有關(guān)部門或機(jī)構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)廣東海洋大學(xué)可以將本學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行檢索，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬于1、保密□，在______年解密后適用本授權(quán)書。2、不保密□?！蹋ㄕ?qǐng)?jiān)谝陨舷鄳?yīng)方框內(nèi)打“√”）馬氏珠母貝血清抗菌活性蛋白的分離純化與鑒定摘要馬氏珠母貝（Pinctadamartensii）是我國(guó)人工海水育珠的主要珍珠貝之一，近年來(lái)因沿海水質(zhì)的日趨惡化，各

3、種病害也頻繁發(fā)生，導(dǎo)致馬氏珠母貝因病害發(fā)生大量死亡，對(duì)我國(guó)珍珠產(chǎn)業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。因此，了解馬氏珠母貝免疫機(jī)制并在此基礎(chǔ)上提高馬氏珠母貝抗脅迫能力是目前亟需解決的問(wèn)題?？咕氖秦愵惿锩庖邫C(jī)制中最重要的一個(gè)環(huán)節(jié)，但目前對(duì)馬氏珠母貝抗菌肽的報(bào)道甚少。本實(shí)驗(yàn)采用多步高效液相色譜結(jié)合質(zhì)譜分析，對(duì)馬氏珠母貝血清中具有抑菌活性的蛋白質(zhì)開(kāi)展了分離純化及鑒定研究，從中獲得三種具有抑菌活性的蛋白質(zhì)成分，分別將這三種抗菌活性蛋白命名為PmECSOD（馬氏珠母貝超氧化物歧化酶，P.martensiiextracellularsuperoxidedismutase），PmCLEC-1（馬氏珠母貝C-型凝集素

4、，P.martensiic-typelectin），PmAMP-1（馬氏珠母貝抗菌肽，P.martensiiantimicrobialpeptide-1）。為了進(jìn)一步了解這三種活性蛋白的基因組成，通過(guò)在馬氏珠母貝的基因組和NCBI提供的珠母貝數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索同源核酸序列并以之為模板設(shè)計(jì)引物，運(yùn)用cDNA末端快速擴(kuò)增（RACE）技術(shù)，成功克隆得到這三種蛋白質(zhì)的cDNA全序列，運(yùn)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR進(jìn)一步研究了三者的組織特異性分布以及細(xì)菌誘導(dǎo)后基因豐度變化情況。結(jié)果如下：1、馬氏珠母貝超氧化物歧化酶（PmECSOD）基因cDNA全長(zhǎng)序列為1864bp，開(kāi)放閱讀框（ORF）為1422bp，編碼473個(gè)

5、氨基酸，N-末端有信號(hào)肽，有20個(gè)氨基酸，成熟肽有453個(gè)氨基酸。氨基酸序列分析顯示，PmCESOD的氨基酸序列具有典型的SOD結(jié)構(gòu)域，在它的N端還有FRI和IGc2兩個(gè)結(jié)構(gòu)域。同源性分析顯示PmECSOD與其它兩種貝類的ECSOD相似性很低，與海灣扇貝太平洋長(zhǎng)牡蠣的相似度是分別是36.42%和28.32%。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，該基因在閉殼肌、外套膜、肝胰腺、鰓、性腺以及血淋巴六個(gè)組織中均有表達(dá)，在鰓中的表達(dá)量最高，在閉殼肌中的表達(dá)量最低。經(jīng)過(guò)誘導(dǎo)刺激之后，48h在血淋巴中表達(dá)含量達(dá)到最高，具有顯著性差異。2、馬氏珠母貝C-型凝集素（PmCLEC-1）基因cDNA全長(zhǎng)序列為636bp，開(kāi)放閱讀

6、框（ORF）為450bp，編碼149個(gè)氨基酸，其中有19個(gè)信號(hào)肽，成熟肽為130個(gè)氨基酸，具有C-型凝集素典型的結(jié)構(gòu)域——糖結(jié)合識(shí)別位點(diǎn)（CDR）。與馬氏珠母貝其他兩種的C-型凝集素PoLEC-1和PoLEC-2對(duì)比，發(fā)現(xiàn)與兩者的相似度很低?？臻g結(jié)構(gòu)顯示PmCLEC-1除了有緊湊結(jié)構(gòu)，在N端還有兩個(gè)Cys。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，在外套膜和肝胰腺的含量最高，而血淋巴中的含量最低。細(xì)菌誘導(dǎo)之后，12h在血淋巴中的表達(dá)含量最高。I3、馬氏珠母貝抗菌肽（PmAMP-1）基因cDNA全長(zhǎng)為700bp，其中開(kāi)放閱讀框?yàn)?06bp，編碼了101個(gè)AA?？臻g結(jié)構(gòu)顯示PmAMP-1為α-螺旋結(jié)構(gòu)。通過(guò)電鏡進(jìn)一步觀

7、察了PmAMP-1對(duì)細(xì)菌的作用機(jī)制。熒光定量分析發(fā)現(xiàn)，在閉殼肌中表達(dá)含量最高，血淋巴中含量最低；經(jīng)細(xì)菌刺激之后，8h在血淋巴中表達(dá)量最高。本實(shí)驗(yàn)首次從馬氏珠母貝血清中獲得三種具有抗菌活性的蛋白質(zhì)成分，為了解馬氏珠母貝體液免疫相關(guān)因子鑒定了基礎(chǔ)，對(duì)研究馬氏珠母貝的免疫機(jī)制蛋白具有重要意義。關(guān)鍵詞：馬氏珠母貝；高效液相色譜；超氧化物歧化酶；C-凝集素；抗菌肽IIPurificationandidentifiedc