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《血清清蛋白、γ-球蛋白分離、純化與純度鑒定》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在教育資源-天天文庫。
1、.血清清蛋白、γ-球蛋白分離、純化與純度鑒定一、實驗目的1.掌握凝膠層析法分離蛋白質的原理和基本方法2.掌握醋酸纖維素薄膜電泳法的原理和基本方法3.掌握離子交換層析法分離蛋白質的原理和基本方法4.掌握鹽析法分離蛋白質的原理和基本方法5.學習柱層析技術二、實驗原理蛋白質的分離和純化是研究蛋白質化學及其生物學功能的重要手段。不同蛋白質的分子量、溶解度及等電點等都有所不同。利用這些性質的差別，可分離純化各種蛋白質。（一）粗提原理-鹽析法1.鹽析法：在蛋白質溶液中,加入無機鹽至一定濃度，或達飽和狀態(tài)，可使蛋白質在水中溶解度降低，從而分離出來。2.水化膜減弱、消失。蛋
2、白質溶液中加入中性鹽后，由于中性鹽與水分子的親和力大于蛋白質，致使蛋白質分子周圍的水化膜減弱乃至消失。3.蛋白質表面的電荷大量被中和。中性鹽加入蛋白質溶液后由于離子強度發(fā)生改變，蛋白質表面的電荷大量被中和，更加導致蛋白質溶解度降低，蛋白質分子之間聚集而沉淀。4.由于血清中各種蛋白質分子的顆粒大小、所帶電荷的多少和親水程度不同，故鹽析所需的鹽濃度也不一樣，調節(jié)鹽的濃度可使不同的蛋白質沉淀從而達到分離的目的。（二）脫鹽原理-凝膠層析1.鹽析分離的蛋白質溶液中含有大量無機鹽，必須先脫鹽后才能進一步純化。2.凝膠層析法主要是根據混合物中各種物質分子大小的不同而將其分
3、離的技術。...（三）純化原理-離子交換層析離子交換層析是指流動相中的離子和固定相上的離子進行可逆的交換，利用化合物的電荷性質及電荷量不同進行分離。（四）純度鑒定-醋酸纖維素薄膜電泳血清中各種蛋白質的等電點不同，一般都低于pH7.4。它們在pH8.6的緩沖液中均解離帶負電荷，在電場中向正極移動。由于血清中各種蛋白質分子大小、形狀及所帶的電荷量不同，在醋酸纖維素薄膜上電泳的速度也不同。因此可以將它們分離為清蛋白（Albumin)、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白、γ-球蛋白5條區(qū)帶。三、材料與方法：（一）實驗材料1.樣品：人混合血清2.試劑：葡聚糖凝膠G
4、-25(SephadexG-25)層析柱、二乙基氨基乙基(DEAE)纖維素離子交換層析柱、各不同濃度的pH6.5醋酸銨緩沖溶液、pH8.6巴比妥緩沖溶液、氨基黑10B染色液、20%磺基水楊酸溶液、飽和硫酸銨溶液、1%BaCl2溶液、漂洗液器材：層析柱、電泳儀、電泳槽、離心機、離心管、黑色反應板等（二）實驗方法取血清1.0ml，邊搖邊緩慢滴加飽和硫酸銨溶液0.8ml，混勻室溫放置10min，4000r/min離心10min1.實驗步驟鹽析沉淀（含球蛋白）加水0.6ml溶解上清液（含清蛋白、少量α球蛋白和β球蛋白）...過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm
5、）過葡聚糖凝膠G-25層析柱（1.0×7cm）用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內壁,流出液量約1ml用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內壁,流出液量約1ml凝膠柱層析除鹽繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(2ml)洗脫磺基水楊酸檢測蛋白質磺基水楊酸檢測蛋白質收集含有蛋白質的峰液15d收集含有蛋白質的峰液15d繼續(xù)用2ml0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌繼續(xù)用0.02mol/LNH4AC緩沖液洗滌約2mlBaCl2檢測至SO42-陰性Ba
6、Cl2檢測至SO42-陰性用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡用2~3ml0.02mol/LNH4AC緩沖液再生平衡離子交換柱層析純化除鹽后收集的球蛋白除鹽后收集的清蛋白過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）過DEAE-纖維素層析柱（1.0×6cm）...用1ml0.02mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內壁,繼續(xù)用0.02mol/LpH6.5NH4AC緩沖液(3ml)洗脫，流出液量約1ml開始檢測蛋白質離子交換柱層析純化用1ml0.06mol/LNH4AC緩沖液清洗層析柱內壁,用約5mL0.06mol/LNH4AC緩沖液流洗，除去α
7、球蛋白和β球蛋白磺基水楊酸檢測蛋白質收集含有蛋白質的洗脫液每管10d，連續(xù)收集3管用0.3mol/LNH4AC緩沖液(約3ml)洗脫，流出液量約2ml開始檢測蛋白質磺基水楊酸檢測蛋白質DEAE-纖維素柱不用再生，可直接用于純化清蛋白收集含有清蛋白的洗脫液每管10d，連續(xù)收集2管取濃度最高的1管作純度鑒定（醋酸纖維素薄膜電泳法）離子交換柱再生和蛋白純度鑒定DEAE-纖維素柱先用6mll.5mol/LNaCl-0.3mol/LNH4AC溶液流洗，再用10ml0.02mol/LNH4AC緩沖液流洗再生平衡2管均作純度鑒定(醋酸纖維素薄膜電泳法)用鑷子取出薄膜，吸去
8、多余的緩沖液，粗面朝上置于載玻片上，在薄膜一段1.5
