資源描述：
《受體相互作用蛋白激酶3轉錄調節(jié)特性研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。
1、SOOCHOWUNIVERSITY蘇州大學學位論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所提交的學位論文是本人在導師的指導下，獨立進行研宄工作所取得的成果。除文中已經(jīng)注明引用的內(nèi)容外，本論文不含其他個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不含為獲得蘇州大學或其它教育機構的學位證書而使用過的材料。對本文的研究作出重要貢獻的個人和集體，均已在文中以明確方式標明。本人承擔本聲明的法律責任。論文作者簽名:日期：蘇州大學學位論文使用授權聲明本人完全了解蘇州大學關于收集、保存和使用學位論文的規(guī)定，艮P:學位論文著作權歸屬蘇州大學。本學位論文電子文檔的內(nèi)容和紙
2、質論文的內(nèi)容相一致。蘇州大學有權向國家圖書館、中國社科院文獻信息情報中心、中國科學技術信息研宄所（含萬方數(shù)據(jù)電子出版社）、中國學術期刊（光盤版）電子雜志社送交本學位論文的復印件和電子文檔，允許論文被查閱和借閱，可以采用影印、縮印或其他復制手段保存和匯編學位論文，可以將學位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關數(shù)據(jù)庫進行檢索。涉密論文口本學位論文屬在____年_月解密后適用本規(guī)定。非涉密論文口hm：^j曰期：/十-?卜1?受體相互作用蛋白激酶3轉錄調節(jié)特性研究中文摘要受體相互作用蛋白激酶3轉錄調節(jié)特性研究中文摘要目的：探討受體相互作用蛋白激酶3
3、(receptorinteractingproteinkinase3,RIPK3)基因啟動子功能序列與轉錄因子的相互作用及其CpG島甲基化狀態(tài)與基因表達水平的關系。方法：（1）采用生物信息學預測并分析啟動子序列后，行啟動子缺失突變轉化分析，即PCR方法對RIPK3基因不同長度的序列片段進行擴增，以熒光素酶載體構建質粒，轉染人胚腎細胞（293T細胞），采用化學發(fā)光儀檢測區(qū)域啟動活性，鑒定功能啟動子的可能區(qū)域。利用軟件預測轉錄因子結合位點，并通過突變轉化分析鑒定RIPK3基因核心轉錄因子的結合位點。（2）在293T細胞中，通過檢測過表達
4、轉錄因子刺激蛋白1(stimulatingprotein1,Sp1)/刺激蛋白3(stimulatingprotein3,Sp3)和Sp1/Sp3顯性負突變體后以及基因選擇性Sp1抑制劑光神霉素處理后啟動子活性的檢測研究轉錄因子刺激蛋白家族與RIPK3啟動子之間的關系。（3）采用凝膠電泳遷移分析（ElectrophoreticMobilityShiftAssay,EMSA）檢測轉錄因子Sp1/Sp3與RIPK3啟動子之間的相互作用關系。（4）采用RNA干擾技術檢測轉錄因子Sp1/Sp3在293T細胞中與RIPK3啟動子的相互作用以及
5、在人大腸癌細胞（HT-29細胞）中與RIPK3表達的作用情況。（5）采用亞硫酸氫鹽修飾后測序法（BisulfitesequencingPCR,BSP）研究在表達與不表達RIPK3的細胞系中以及甲基化抑制劑處理后的不表達RIPK3的細胞系中甲基化在RIPK3基因啟動子區(qū)域的修飾情況。結果：（1）化學發(fā)光實驗表明：RIPK3基因的5'非翻譯區(qū)(5'-non-translatedregion,5'UTR)和轉錄起始位點(transcriptionalstartsite,TSS)上游19個堿基片段是RIPK3基因啟動子的功能序列；缺失突變轉
6、化分析提示該功能序列包含三個GC盒(GCbox)，其中第二個為RIPK3基因轉錄因子Sp1/Sp3的核心結合位點。（2）過表達研究結果表明，Sp1/Sp3對RIPK3基因啟動子活性激活起主導作用。（3）凝膠電泳遷移分析的結果證實轉錄因子Sp1/Sp3與GC富集區(qū)特異性相互作用。（4）Sp1小干擾RNA或Sp3小干擾RNA與RIPK3啟動子功能區(qū)和熒光素酶載體構建的質粒共同轉染293T細胞，比較得出RIPK3啟動子活性明顯減低。（5）亞硫酸氫鹽修飾I中文摘要受體相互作用蛋白激酶3轉錄調節(jié)特性研究后測序法實驗結果表明，在表達RIPK3的
7、HT-29細胞系中RIPK3基因啟動子功能序列低度甲基化，在不表達RIPK3的結腸癌細胞（HCT-116細胞）中RIPK3啟動子功能序列呈現(xiàn)高度甲基化。5-氮-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine,5-aza-CdR)處理后，HCT-116細胞里RIPK3啟動子功能序列甲基化的頻率明顯下降，RIPK3表達相應上調。結論：RIPK3基因的5'UTR及TSS上游19個堿基序列片段是RIPK3基因啟動子的功能序列。RIPK3基因的啟動活性受刺激蛋白1和刺激蛋白3劑量依賴調控。在不表達RIPK3的HCT-116里，R
8、IPK3基因的功能啟動序列呈現(xiàn)的甲基化頻率很高。該細胞系使用5-aza-CdR處理后，RIPK3基因的功能啟動序列呈現(xiàn)的甲基化頻率較前明顯下降，其蛋白表達相應上調。以上結果提示，日后在治療RIPK3相關的臨床疾病過程中，我們可以嘗試通
