玉米孤雌生殖單倍體胚遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的初步研究

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1、分巧號Ｓ５１３學(xué)號Ｓ２０１２２０４９四川巧業(yè)大學(xué)ｄｂｒ位論文玉米孤雌生殖單倍體胚遺傳轉(zhuǎn)化體系建立的初步研究陳巧指導(dǎo)教師巧光堂巧巧林海建副研巧員‘■？學(xué)科專業(yè)作物遺傳育種＇＇，研究方向玉乂單倍體育種，Ｉ．，？■、、■￣、２０１５年５月Ｖ？＼ＳｉｃｈｕａｎＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＭａｓｔｅｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＰｒｅｌｉｍｉｎａｒＳｔｕｄ０凸ｔｈｅＥｓｔａｂｌｉｓｈｍ

2、ｅｎｔｏｆｙｙＧｅｎｅｔｉｃＴｒａｎｓｆｏｒｍａｔｉｏｎＳｓｔｅｍｉｎＭａｉｚｅｙＰａｒｔｈｅｎｏｅｎｅｓｉｓＨａｌｏｉｄＥｍｂｒｏｓｇｐｙＣｈｅｎＱｉ（ＣｒｏｐＧｅｎｅｔｉｃａｎｄＢｒｅｅｄｉｎｇ）Ｄ－－ｉｒｅｃｔｅｄｂＰａｎＧｕａｎｔａｎａｎｄＬｉｎＨａｉｉａｎｙｇｇｊＭａ２０１５ｙ論文獨創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的學(xué)位論文是我個人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行研究工作所取得的成果。盡我所知，除了文中特別加Ｗ標(biāo)注和致謝的化方外，學(xué)位論文中不包含其他

3、個人或集體已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得四川農(nóng)業(yè)大學(xué)或其它教育機一構(gòu)的學(xué)位或證書所使用過的材料。與我同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。＾研究生簽名：年備月ｒ曰、Ｉ巧＾口了關(guān)于論文使用巧巧的聲明本人完全了解四川農(nóng)業(yè)大學(xué)有關(guān)保留、使Ｗ學(xué)位論文的規(guī)定，即：學(xué)校有權(quán)保留并向國家有關(guān)部口或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許論文被巧閱和借閱，可Ｗ采Ｗ影印、縮印或掃描巧復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。同意四川農(nóng)業(yè)火學(xué)可Ｗ用不同方式化不同媒體上發(fā)表、

4、傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容。。□本論文保密，在解密后適用本授權(quán)。囚本論文不保密＿年＂＂（請在Ｗ上□內(nèi)劃Ｖ）＇＾，研究生簽名：戸辯年《月ＪＴ曰導(dǎo)師簽名：年／月日一ｒｊ摘要本研究將玉米孤雌生殖單倍體胚作為外植體，在二倍體胚的遺傳再生與轉(zhuǎn)化條件的基礎(chǔ)上對部分條件進行優(yōu)化，成功摸索出單倍體幼化培養(yǎng)中的倍性鑒定方法，成功獲得了單倍體再生植株和轉(zhuǎn)基因陽性植株，初步建立了孤雌生殖單倍體幼胚遺傳再生體系和轉(zhuǎn)化體系；與此同時，利用單倍體成熟胚作為受體進行遺傳轉(zhuǎn)化，不經(jīng)成熟勝一較為困

5、難的脫分化過程而直接再生為單倍體植株。本研究探索了套新的轉(zhuǎn)基因方法，一個新的可能和方向為單倍體育種的應(yīng)用提供了。同時，本研究還對轉(zhuǎn)基因過程中單倍體、二倍體與雜合體之間的亞細(xì)胞結(jié)構(gòu)差異進行了比較分析，為單倍體遺傳轉(zhuǎn)化體一系的建立提供了定的理論支持。具體地，本研究得到如下結(jié)果：８－民為母（１）本實驗Ｗ玉米孤雌生殖誘導(dǎo)系ＥＤＩ為父本，１５９９本雜交誘導(dǎo)單倍體，利用誘導(dǎo)系標(biāo)記基因的特性對幼化誘導(dǎo)后的愈傷組織進行光照條件的篩選，發(fā)現(xiàn)雜合個體的愈傷組織呈現(xiàn)出紫色，而單倍體個體的愈傷組織仍為黃色，且光照方式

6、對篩選單倍體個體的效果不顯著，而光照時間間的差異達(dá)到了極顯著水平，其中２０ｈ、４０ｈ下可成功分離篩選出單倍體愈傷組織。但由于４０ｈ水平下，愈傷組織出現(xiàn)了變綠，由朝分化方向發(fā)展的趨勢，不利于后期實驗的培養(yǎng)，因此最終確定單倍體愈傷組織初步篩選的光照條件為光照培養(yǎng)２０ｈ，光照強度２０００１Ｘ。（２）由于光照篩選不能完全將非單倍體剔除，標(biāo)記基因的顯現(xiàn)與植株組織的基因型一及成熟度有關(guān)，因此我們還需進步準(zhǔn)確地確定出單倍體個體，本實驗利用經(jīng)光照篩一選后再通過染色體壓片篩選、流式細(xì)胞檢測篩選這樣套單倍

7、體鑒定的方法，最終從３０００顆幼化中獲得１１０份單倍體材料，單倍體率為３．６７％，與誘導(dǎo)系ＥＤＩ的誘導(dǎo)率一３。（．５％）相近，從而實現(xiàn)對材料致性的保證（３）本實驗通過對分化過程中的激素配比進行正交設(shè)計優(yōu)化，我們發(fā)現(xiàn)處理（ＫＴ（０．－＋Ｎ５ｍ／Ｌ）＋６－ＢＡ／／Ｌ）＋２４Ｄ（１ｍ／Ｌ）ｍ／Ｄ）（０．５ｍＬ）＋ＡＢＡ（０．５ｍＡＡ（０．１ｇｇｇ，ｇｇ的單倍體成苗率顯著高于其他組合，且對不同因素的不同處理濃度進行分析，結(jié)果均不顯著。因此，對其中的不顯著因素須將不同因素的水平梯度

8、設(shè)定范圍加大，從而篩選出主要因素的最佳水平。８－（４）本實驗通過對１巧９民單倍體幼胚誘導(dǎo)的愈傷組織進行再生和轉(zhuǎn)化，成功地獲Ｉ得了１３株再生單倍體植株、１５株再生雙單倍體植株及４個單倍體陽性個體。本實驗－利用授粉口１４ｄ左右的扭１１單倍體成熟臟進行轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化后直接再生成為植株，跳１４過了成熟胚困難的愈傷組織誘導(dǎo)及培養(yǎng)階段