石斛多糖干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂及成骨分化的研究

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1、碩士學(xué)位論文論文題目：石斛多糖干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂及成骨分化的研究作者姓名徐路加指導(dǎo)教師華允芬學(xué)科專業(yè)藥學(xué)所在學(xué)院藥學(xué)院提交日期2015年4月M.S.ThesisStudyoftheeffectofdendrobiumpolysaccharidesonadipogenicdifferentiationandosteogenicdifferentiationofratbonemarrowmesenchymalstemcellsXuLujiaCollegeofPharmaceuticalSciencesZhejiangUniversity

2、ofTechnologyHangzhou,P.R.ChinaApril2015漸江工業(yè)大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重靑明：所提交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下，獨立進行研究工作而取得的研究成果。除文中已加＾＾１標(biāo)注引用的內(nèi)容除外，本論文不包括其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得浙化工業(yè)大學(xué)或其它的教育機構(gòu)的學(xué)位證書而使用過的相關(guān)材料。對本文的研究做出重要貢獻的個人巧集體，均已在文中用明確方式標(biāo)明。本人承擔(dān)本聲明的法律責(zé)任。＾作者簽名；！ｆ卑＾月：系妥合如曰期；次／曰學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)

3、書本學(xué)位論文的作者売全了解學(xué)校相關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，同意學(xué)校保留并向國家相關(guān)部口或機構(gòu)送交本論文的復(fù)印件及浙江工化大學(xué)可ｔｕ將本學(xué)位論文的全部或部分電子版，允許本論文被查閱和借闊。本人授權(quán)＾１＞、將部分內(nèi)容編入有關(guān)的數(shù)據(jù)庫進行檢秦，可：采用影印縮印或巧描等復(fù)制方式保存和匯編本學(xué)位論文。本學(xué)位論文屬子１、保密□，在年解密后患用本授權(quán)書。／２、不保密從‘’（請在上相應(yīng)方框內(nèi)打Ｖ）作者簽名：游棘日期：＞＾戸年名月日／導(dǎo)師簽名；日期Ｉｆ年＾月Ｉ日本課題的研究得到了浙江省自然科學(xué)基金項目（

4、LQ12C02003）的資助，特此表示感謝！石斛多糖干預(yù)大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞成脂及成骨分化的研究摘要近年來，天然藥物逐漸引起了人們的重視，天然藥物作為藥物在臨床上也得到了廣泛應(yīng)用。石斛是我國傳統(tǒng)名貴中藥，藥效顯著，應(yīng)用歷史悠久，其具有的諸多功效已在幾千年的中醫(yī)臨床實踐中得到驗證。本論文主要研究了鐵皮石斛（Dendrobiumofficinale）和銅皮石斛（Dendrobiummoniliforme）多糖對大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（bonemesenchymalstemcells，BMSCs）成脂及成骨分化的影響，并嘗試通過現(xiàn)代分子生物學(xué)理論來解

5、釋石斛“滋陰補腎”的傳統(tǒng)功效，為今后更好的利用中藥石斛資源提供科學(xué)依據(jù)。本實驗內(nèi)容主要包括以下4個部分：1.采用常規(guī)的溶劑浸提法提取鐵皮石斛多糖和銅皮石斛多糖，并通過乙醇沉淀，Sevage法除蛋白等一系列操作對石斛多糖進行初步分離純化。所提取的鐵皮石斛多糖得率為20.4%，銅皮石斛多糖得率為10.6%。濃硫酸-苯酚比色法測得本次實驗中所提取的鐵皮石斛和銅皮石斛粗多糖中多糖含量分別為76.4%、67.5%，表明所提取的石斛多糖具有比較高的純度。2.采用全骨髓貼壁篩選法分離得到SD大鼠骨髓間充質(zhì)干細胞（BMSCs），并進行傳代培養(yǎng)，倒置顯微鏡下進

6、行細胞形態(tài)學(xué)觀察，并采用流式細胞儀檢測細胞表面特異性標(biāo)志物的表達情況。臺盼藍拒染法檢測細胞活力，噻唑藍（MTT）比色法測定細胞生長曲線及不同石I斛多糖對BMSCs生存率的影響。結(jié)果表明：分離得到的大鼠BMSCs在顯微鏡下呈紡錘形、梭形、漩渦狀生長，形態(tài)均一，細胞活力可達95%以上。流式細胞儀檢測細胞表面標(biāo)志物表達正常，基本不表達造血細胞標(biāo)志物CD45，表達CD105。細胞生存率實驗表明質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖對BMSCs的生存率無顯著影響，表明在此濃度范圍內(nèi)石斛多糖對BMSCs無細胞毒性。3.誘導(dǎo)BMSCs成脂

7、分化，添加質(zhì)量濃度為50～800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖分別進行干預(yù)，干預(yù)成脂分化10天、20天后，油紅O染色并定量檢測，實時熒光定量PCR檢測過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARG）、脂蛋白脂肪酶（LPL）、脂肪酸結(jié)合蛋白4（FABP4）的mRNA表達水平。實驗結(jié)果：質(zhì)量濃度為400、800μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖均能顯著降低油紅O染色后的吸光值，下調(diào)PPARG、LPL、FABP4的mRNA表達。結(jié)果表明，在一定質(zhì)量濃度下，兩種石斛多糖可顯著抑制BMSCs成脂分化。4.誘導(dǎo)BMSCs成骨分化，添加質(zhì)量濃度為50～800

8、μg/mL的鐵皮石斛和銅皮石斛多糖分別進行干預(yù)，干預(yù)成骨分化7天后，進行堿性磷酸酶（ALP）染色、誘導(dǎo)分化28天后，進行茜素紅染色。用實時熒光定量PCR檢測核心結(jié)合