蛋白質(zhì)地定量測定實(shí)驗(yàn)報(bào)告材料

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1、實(shí)驗(yàn)名稱(TitleofExperimetn)蛋白質(zhì)的定量測定（Folin-酚試劑法）實(shí)驗(yàn)日期(DateofExperiment)XXXX實(shí)驗(yàn)地點(diǎn)(LabNo.)XXXX合作者(Partner)XXXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日期(Date)一、實(shí)驗(yàn)預(yù)習(xí)1.0實(shí)驗(yàn)?zāi)康膌初步了解各種蛋白質(zhì)含量測定的常用方法。l掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理及熟悉和掌握實(shí)驗(yàn)操作技術(shù)。l掌握用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲線和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)管方法求

2、樣品溶液中待測定物質(zhì)含量。1.1實(shí)驗(yàn)原理1.1.1總體概述Folin-酚試劑法是經(jīng)過科學(xué)家改進(jìn)的測定蛋白質(zhì)含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法：利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。而后，Lowry對此法進(jìn)行了改進(jìn)，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：，故使得實(shí)驗(yàn)的精確度大大提高，但同時(shí)也存在著干擾物質(zhì)多、費(fèi)時(shí)、操作嚴(yán)格計(jì)時(shí)等問題。1.1.2雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中，雙縮脲（）能和作用，發(fā)生配位反應(yīng)，形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，即為雙縮脲反

3、應(yīng)。由于蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的分子中肽鍵能和堿性銅試劑中的作用，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-復(fù)合物。對于蛋白質(zhì)的測定來說，這一步是基礎(chǔ)，這也是Folin-酚法的基礎(chǔ)原理。1.1.3Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物還原而呈現(xiàn)藍(lán)色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質(zhì)-復(fù)合物含有的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。故可以利用上述兩種反應(yīng)通

4、過分光光度法測定待測樣品的蛋白質(zhì)含量。1.1.4分光光度法測定樣品的蛋白質(zhì)的含量本實(shí)驗(yàn)以上述兩個(gè)反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，再通過設(shè)置空白對照組，標(biāo)準(zhǔn)管中設(shè)置蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的一系列濃度梯度（，，，）通過分光光度計(jì)測定吸光度，從而獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品管通過測定的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到較為準(zhǔn)確對應(yīng)的含量。1.2實(shí)驗(yàn)材料1.2.1實(shí)驗(yàn)樣品①血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）1.2.2實(shí)驗(yàn)試劑①200mg/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（BSA）；②堿性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時(shí)該溶液必須新鮮配制，當(dāng)日

5、有效）；③Folin-酚試劑（配制過程較為復(fù)雜）注：此次實(shí)驗(yàn)所用的試劑全部已由老師制備好，所以無配制過程，但需知道配制流程，可查閱實(shí)驗(yàn)書P105。1.2.3實(shí)驗(yàn)儀器及器材①V-1100可見光分光光度計(jì)；②恒溫水浴箱；③試管6支、試管架；④加樣槍、加樣槍架。1.3實(shí)驗(yàn)步驟1.3.1實(shí)驗(yàn)流程溶液混合滴加堿性硫酸銅靜置10min加入Folin-酚試劑水浴10min比色測定繪圖取結(jié)果1.3.2實(shí)驗(yàn)步驟步驟操作（1）反應(yīng)體系設(shè)置取6只潔凈的試管，利用加樣槍按要求量取相應(yīng)量的溶液，混合均勻（各試管的需加入的試劑和量見下表）

6、：試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管123456牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5（2）雙縮脲反應(yīng)每隔一分鐘，依次往1號(hào)試管到6號(hào)試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時(shí)間，室溫靜置10min（3）Folin-酚反應(yīng)①將靜置時(shí)間達(dá)到10min中的試管中，加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻（一般在2s以內(nèi)）。②在40下水浴加熱10min鐘同樣需計(jì)時(shí)。③10min鐘后取出冷卻至室溫。（4）比色測定①轉(zhuǎn)動(dòng)波長旋鈕，調(diào)

7、制500.0nm，按“mode”鍵切換到T檔，分別將1-6號(hào)試管中混合液放入比色杯中利用1號(hào)試管為空白，校置100；②調(diào)至A檔，依次測定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。③重復(fù)操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見表1（5）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測得的數(shù)據(jù)，繪制以值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)的準(zhǔn)備曲線，具體繪制利用excel制作，結(jié)果可見圖2（6）測樣品蛋白質(zhì)含量根據(jù)樣品管（6管）的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中

8、蛋白質(zhì)的微克數(shù)(mg/ml)。血清蛋白濃度(mg/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為60~80g/L。1.3.3注意事項(xiàng)①試劑要求：實(shí)驗(yàn)所需的試劑必須是新鮮配制，不然會(huì)存在被空氣及其他物質(zhì)氧化還原的情況，干擾實(shí)驗(yàn)的測定。②控制時(shí)間：Lowry反應(yīng)的顯色隨時(shí)間不斷加深，因此各項(xiàng)操作必須精確控制時(shí)間。嚴(yán)格按照實(shí)驗(yàn)步驟的操作，規(guī)定的時(shí)間是多少就多少。水浴時(shí)間也不