蛋白質(zhì)的定量測定實驗報告

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1、WORD資料下載可編輯實驗名稱(TitleofExperimetn)蛋白質(zhì)的定量測定（Folin-酚試劑法）實驗日期(DateofExperiment)XXXX實驗地點(LabNo.)XXXX合作者(Partner)XXXX指導(dǎo)老師(Instructor)XXXX總分(TotalScore)教師簽名(Signature)批改日期(Date)一、實驗預(yù)習(xí)1.0實驗?zāi)康膌初步了解各種蛋白質(zhì)含量測定的常用方法。l掌握Folin-酚試劑法測定蛋白質(zhì)含量的原理及熟悉和掌握實驗操作技術(shù)。l掌握用excel制作標(biāo)準(zhǔn)曲

2、線和通過標(biāo)準(zhǔn)曲線及標(biāo)準(zhǔn)管方法求樣品溶液中待測定物質(zhì)含量。1.1實驗原理1.1.1總體概述Folin-酚試劑法是經(jīng)過科學(xué)家改進的測定蛋白質(zhì)含量的方法，F(xiàn)olin首創(chuàng)這種方法：利用蛋白質(zhì)分子中酪氨酸和色氨酸殘基（酚基）還原酚試劑（磷鎢酸-磷鉬酸）起藍(lán)色反應(yīng)。而后，Lowry對此法進行了改進，先于標(biāo)本中加堿性銅試劑，再與酚試劑反應(yīng)，提高了靈敏度，靈敏度的范圍為：，故使得實驗的精確度大大提高，但同時也存在著干擾物質(zhì)多、費時、操作嚴(yán)格計時等問題。1.1.2雙縮脲反應(yīng)在堿性溶液中，雙縮脲（）能和作用，發(fā)生配位反應(yīng)，

3、形成紫色或紫紅色的絡(luò)合物，即為雙縮脲反應(yīng)。專業(yè)資料分享WORD資料下載可編輯由于蛋白質(zhì)的肽鍵結(jié)構(gòu)與雙縮脲結(jié)構(gòu)相似，故在堿性溶液中，蛋白質(zhì)的分子中肽鍵能和堿性銅試劑中的作用，生成紫紅色的蛋白質(zhì)-復(fù)合物。對于蛋白質(zhì)的測定來說，這一步是基礎(chǔ)，這也是Folin-酚法的基礎(chǔ)原理。1.1.3Folin-酚顯色反應(yīng)Folin-酚試劑在堿性條件下極不穩(wěn)定，其磷鉬酸鹽-磷鎢酸鹽易背酚類化合物還原而呈現(xiàn)藍(lán)色。酪氨酸（Tyr）含有酚羥基，故蛋白質(zhì)-復(fù)合物含有的酪氨酸或色氨酸殘基還原酚試劑中的磷鉬酸和磷鎢酸，生成藍(lán)色的化合物。

4、在一定的濃度范圍內(nèi)，藍(lán)色的深淺與蛋白質(zhì)的濃度呈線性關(guān)系。故可以利用上述兩種反應(yīng)通過分光光度法測定待測樣品的蛋白質(zhì)含量。1.1.4分光光度法測定樣品的蛋白質(zhì)的含量本實驗以上述兩個反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，再通過設(shè)置空白對照組，標(biāo)準(zhǔn)管中設(shè)置蛋白標(biāo)準(zhǔn)液的一系列濃度梯度（，，，）通過分光光度計測定吸光度，從而獲取標(biāo)準(zhǔn)曲線，樣品管通過測定的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到較為準(zhǔn)確對應(yīng)的含量。1.2實驗材料1.2.1實驗樣品①血清稀釋液（正常人血清稀釋300倍）1.2.2實驗試劑①200mg/ml牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)液（BSA）；②堿

5、性硫酸銅溶液（組成：堿溶液與硫酸銅溶液按50:1混合而成，使用時該溶液必須新鮮配制，當(dāng)日有效）；③Folin-酚試劑（配制過程較為復(fù)雜）注：專業(yè)資料分享WORD資料下載可編輯此次實驗所用的試劑全部已由老師制備好，所以無配制過程，但需知道配制流程，可查閱實驗書P105。1.2.3實驗儀器及器材①V-1100可見光分光光度計；②恒溫水浴箱；③試管6支、試管架；④加樣槍、加樣槍架。1.3實驗步驟1.3.1實驗流程溶液混合滴加堿性硫酸銅靜置10min加入Folin-酚試劑水浴10min比色測定繪圖取結(jié)果1.3.

6、2實驗步驟步驟操作（1）反應(yīng)體系設(shè)置取6只潔凈的試管，利用加樣槍按要求量取相應(yīng)量的溶液，混合均勻（各試管的需加入的試劑和量見下表）：試劑空白管標(biāo)準(zhǔn)管樣品管123456牛血清蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)液00.20.40.60.80樣品液000000.5蒸餾水1.00.80.60.40.20.5（2）雙縮脲反應(yīng)專業(yè)資料分享WORD資料下載可編輯每隔一分鐘，依次往1號試管到6號試管中加入2mL的堿性硫酸銅溶液，搖勻并記錄每支試管的加入硫酸銅時間，室溫靜置10min（3）Folin-酚反應(yīng)①將靜置時間達(dá)到10min中的試管中，

7、加入0.20mL的Folin-酚試劑，快速搖勻（一般在2s以內(nèi)）。②在40下水浴加熱10min鐘同樣需計時。③10min鐘后取出冷卻至室溫。（4）比色測定①轉(zhuǎn)動波長旋鈕，調(diào)制500.0nm，按“mode”鍵切換到T檔，分別將1-6號試管中混合液放入比色杯中利用1號試管為空白，校置100；②調(diào)至A檔，依次測定2-6試管的吸光度，并讀取數(shù)據(jù)。③重復(fù)操作，再讀取數(shù)據(jù)2次，并記錄。數(shù)據(jù)表格見表1（5）繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線利用測得的數(shù)據(jù)，繪制以值為縱坐標(biāo)，牛血清清蛋白標(biāo)準(zhǔn)液濃度為橫坐標(biāo)的準(zhǔn)備曲線，具體繪制利用excel制

8、作，結(jié)果可見圖2（6）測樣品蛋白質(zhì)含量根據(jù)樣品管（6管）的吸光度值，在標(biāo)準(zhǔn)曲線中找到對應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度，再乘以稀釋倍數(shù)（300），得出每毫升未稀釋血清含蛋白質(zhì)的微克數(shù)，即每毫升血清中蛋白質(zhì)的微克數(shù)(mg/ml)。血清蛋白濃度(mg/ml)=樣品蛋白質(zhì)濃度×2×300參考：正常人血清蛋白濃度范圍為60~80g/L。1.3.3注意事項①試劑要求：實驗所需的試劑必須是新鮮配制，不然會存在被空氣及其他物質(zhì)氧化還原的情況，干擾實驗的測定。專業(yè)資料分享W