張賽-免疫層析技術(shù)研究進(jìn)展

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1、免疫層析技術(shù)研究進(jìn)展引言免疫層析測(cè)定法（ImmunoehromtogaphicAssay，簡(jiǎn)稱ICA）是出現(xiàn)于20世紀(jì)80年代初期，將免疫標(biāo)記技術(shù)與層析技術(shù)結(jié)合的一種新型檢測(cè)技術(shù)。它是利用標(biāo)記物的顯色特性及層析法的分離技術(shù)定性、半定量或定量地檢測(cè)待測(cè)物。以膠體金標(biāo)記為代表的免疫層析方法已廣泛應(yīng)用于各種標(biāo)志物檢測(cè)中，但由于膠體金免疫層析只能用于定性或半定量的檢測(cè)，難以滿足臨床檢測(cè)指標(biāo)定量化的要求；同時(shí)檢測(cè)結(jié)果靠肉眼判斷，特別是在檢測(cè)結(jié)果呈弱陽(yáng)性時(shí)，極易造成人為漏檢現(xiàn)象，因此存在靈敏度較低等問(wèn)題。而一些新型免疫層析技術(shù)不存在膠體金需大量聚集才能顯色的缺點(diǎn)

2、，其以特有的光電磁信號(hào)放大系統(tǒng)提高檢測(cè)靈敏度，減少樣品的本底干擾，擁有傳統(tǒng)標(biāo)記物所無(wú)法比擬的優(yōu)勢(shì)。免疫層析技術(shù)正朝著定量、高靈敏度、多標(biāo)記檢測(cè)等方向發(fā)展。本文對(duì)現(xiàn)有免疫層析技術(shù)的原理、特點(diǎn)及其應(yīng)用進(jìn)行闡述并探討快速免疫檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展趨勢(shì)。1膠體金免疫層析技術(shù)1.1膠體金免疫快速診斷技術(shù)的原理膠體金免疫層析法（GICA）是在單克隆抗體技術(shù)、膠體金標(biāo)記技術(shù)以及免疫層析技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的快速體外診斷技術(shù)，是繼放射免疫分析、酶免疫分析和熒光免疫分析三大技術(shù)之后，應(yīng)用最為廣泛的免疫分析技術(shù)。該技術(shù)主要是將特異性的抗原或抗體以條帶狀固定在硝酸纖維素膜（NC膜

3、）上，膠體金標(biāo)記試劑吸附在結(jié)合墊上，當(dāng)待測(cè)樣品加到試紙條一端的樣品墊上后，通過(guò)毛細(xì)作用向前移動(dòng)，溶解結(jié)合墊上的膠體金標(biāo)記試劑后相互反應(yīng)，再移動(dòng)至固定的抗原或抗體的區(qū)域時(shí)，待測(cè)物和金標(biāo)試劑的復(fù)合物又與之發(fā)生特異性結(jié)合而被截留，聚集在檢測(cè)帶上，通過(guò)可目測(cè)的膠體金標(biāo)記物得到直觀的顯色結(jié)果。而流離標(biāo)記物則越過(guò)檢測(cè)帶，達(dá)到與結(jié)合標(biāo)記物自動(dòng)分離的目的。目前主要有四種方法用于快速診斷技術(shù)上：1）雙抗夾心法：用于檢測(cè)病原微生物性的大分子抗原的檢測(cè)[1,2]；2）競(jìng)爭(zhēng)法：用于檢測(cè)小分子抗原[3-5]；3）雙抗原夾心法：用于檢測(cè)特異性的抗體[6]；4）反向流動(dòng)層析法：此

4、法可以同時(shí)檢測(cè)同種病原微生物的抗體IgG和IgM[7]。此外還有雙面試紙條法（可同時(shí)檢測(cè)IgG和IgM），間接法（用于檢測(cè)體液中的抗體成分）和捕獲法（常用于檢測(cè)IgM，可用于傳染病的早期診斷），后兩種方法在免疫層析試驗(yàn)中應(yīng)用較少。1.2膠體金免疫層析技術(shù)優(yōu)點(diǎn)膠體金技術(shù)利用金顆粒可催化銀離子還原成金屬銀這一原理，采用銀顯影劑增強(qiáng)金顆粒的可見(jiàn)性，大大提高測(cè)定靈敏度，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明可達(dá)到ELISA的靈敏度水平。膠體金大多用于單克隆抗體標(biāo)記，對(duì)組織細(xì)胞的非特異性吸附作用小，故具有較高的特異性。檢測(cè)一般只要5～10min就會(huì)出結(jié)果，相比其它方法（如ELISA需1

5、～2h，PCR需要時(shí)間更長(zhǎng)）大大的縮短了檢測(cè)時(shí)間。檢測(cè)結(jié)果直接用顏色顯示，肉眼判斷容易，不需要特別儀器設(shè)備，只需要試紙條或滲濾試劑盒，樣品只要做非常簡(jiǎn)單的處理或不需要做前處理（可以是組織液、血清、糞便和尿液等）。而且成本較低，操作簡(jiǎn)單，試劑非常穩(wěn)定，不受溫度等外界因素影響，因而可在醫(yī)院、家里、辦公場(chǎng)所甚至野外進(jìn)行各種疾病的檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果也可長(zhǎng)期保存。1.3膠體金快速診斷技術(shù)的研究和應(yīng)用膠體金免疫層析技術(shù)因其方便靈敏、簡(jiǎn)單快速及穩(wěn)定性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)已廣泛用于診斷領(lǐng)域中，如病原體抗原抗體[8,9]、人體疾病相關(guān)蛋白[10]、藥物濫用[11]以及寄生蟲相關(guān)抗原抗

6、體的檢測(cè)[12]等。膠體金免疫層析雖有很多優(yōu)點(diǎn)，但在實(shí)際應(yīng)用中也存在一些不足，例如，膠體金與抗原/抗體之間通常是采用物理吸附的方法結(jié)合的，這就造成了膠體金標(biāo)記物的不穩(wěn)定，抗原/抗體容易從金納米顆粒表面脫落下來(lái)；膠體金免疫層析只能給出定性或半定量的結(jié)果，由于儀器的限制，目前還能準(zhǔn)確的定量，這些不足也是膠體金免疫層析技術(shù)未來(lái)發(fā)展的主要方向。2新型免疫層析技術(shù)概況目前，已經(jīng)應(yīng)用于免疫層析標(biāo)志物的新型納米材料包括、熒光膠乳、量子點(diǎn)（quantumdots,QDs）上轉(zhuǎn)磷光納米粒子（up-convertingphosphor,UCP）、納米磁珠等幾大類。這些新

7、興的標(biāo)記方法有效規(guī)避了吸收光譜型標(biāo)記物（膠體金、膠體硒、乳膠微球）須大量聚集才能顯色的缺點(diǎn)，也有效減少了樣本的本底干擾，在層析檢測(cè)中顯示了更大的潛力。2.1熒光膠乳標(biāo)記免疫層析熒光膠乳是指將熒光染料通過(guò)物理吸附法、自組裝法、化學(xué)鍵合法、共聚法、包埋法等[13]方法吸附或包埋到粒子內(nèi)而形成的直徑在納米至微米級(jí)（0.01~10μm）范圍內(nèi)，受激發(fā)光源激發(fā)能發(fā)出熒光的固體微粒。在微球殼結(jié)構(gòu)的作用下，它具有相對(duì)穩(wěn)定的形態(tài)結(jié)構(gòu)，粒度均一、單分散性好、穩(wěn)定性好、發(fā)光效率高、重復(fù)性好，有較好的生物相容性。形成微球后染料熒光猝滅大大減少，發(fā)射強(qiáng)而穩(wěn)定，且基本不受外界

8、環(huán)境介質(zhì)變化的影響[14]。該乳膠層析法具有特異性強(qiáng)、靈敏度高的特點(diǎn)，比一般的膠體金等固相免疫靈敏10～10