免疫親和層析技術.doc

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1、免疫親和層析技術原理、目的、儀器、方法、步驟、結果、討論、體會一、實驗背景親和層析技術是純化各種生物大分子的有效方法。最初是將抗體作為一種結合劑用于免疫親和層析，根據(jù)抗原抗體結合后形成大量多聚體和不溶性基質原理來收集抗原。隨后，利用抗體與惰性微珠共價交聯(lián),雖然這種反應是一種簡單的結合，但抗體的活性因交聯(lián)缺乏定位作用或抗體的過量交聯(lián)而喪失。通過研究發(fā)現(xiàn)，抗體與蛋白A或蛋白G微珠共價交聯(lián)后更容易與抗原結合。將具有良好抗原結合特性，且來源廣泛的各種單克隆抗體制成免疫親和層析柱，已成為一種實用和有效的純化方法。?

2、???免疫親合層析具有以下特點：①抗體與其相應抗原結合具有高度親和力和特異性,能大量分離天然狀態(tài)或近似天然狀態(tài)的抗原；②不是所有的抗體都適用于免疫親和層析，但一旦獲得一種性能良好的抗體，純化過程就簡單、快速、可靠；③可按照不同規(guī)模進行，半天內(nèi)即可完成，而且可以獲得其他層析法不可比擬的純化效果；④經(jīng)過簡單的改進，免疫親和層析法也可用于純化針對抗原的特異性抗體。????免疫親和層析是一種既簡單又非常有效的分離抗原的技術。即將抗體共價結合到一種惰性的微珠上，然后將微珠與含有待純化抗原的溶液混合。當抗原被交聯(lián)在微

3、珠上的抗體捕獲后，通過洗滌去除無關的抗原，然后用洗脫緩沖液處理微珠，結合的抗原被洗脫，從而得到純化的抗原。如果洗脫條件掌握較好而且比較溫和，純化的抗原仍能保持其天然狀態(tài)。雖然下述的所有實例都是以蛋白質抗原作為研究對象，但凡是能與抗體有效結合的分子都能用這種方法進行純化。????只需簡單地改變操作程序，免疫親和層析法同樣也可以用來分離經(jīng)過初步純化的抗體。此時抗原和抗體所起的作用正好相反，抗原共價交聯(lián)在微珠上，再與抗體結合，然后通過洗脫，得到純化的抗體。????在條件合適的情況下，應用免疫親和層析法通常只需一

4、次就可以達到1000~10000倍的純化效果。使用性能特別優(yōu)良的抗體，并且掌握好洗脫條件，也可以達到10000倍以上的純化效果。二、實驗原理親和層析是吸附層析技術的一種。它是近十多年來迅速發(fā)展并被廣泛用于分離純化生物大分子的一種十分有效的方法，具有分離速度快、純化效率高等優(yōu)點；尤其適合于含量少、雜質多，采用常規(guī)方法難于分離的生物活性分子。親和層析的主要依據(jù)是生物分子與其特定的固相化的配基或者配體之間具有一定的親和力而使生物分子得以分離。生物分子的理化特性使其可以與某些分子發(fā)生可逆的特異性結合（如分子間通過

5、氫鍵等次級鍵結合，但條件改變后即可分離）的特性。本實驗利用抗原/抗體和相應的抗體/抗原可以發(fā)生特異性的結合，而這種結合在一定的條件下可逆的性質將牛血清白蛋白（BSA，抗原）固相化后，使存在于液相中的抗體選擇性地結合到固相載體上，借以與液相中的其他蛋白質分離，以此來達到分離純化抗體的目的。實驗所用載體為葡聚糖凝膠，所用交聯(lián)劑為1,4-丁二醇二縮水甘油。其原理如圖所示：圖1.免疫親和層析原理圖一、實驗目的（1）理解親和層析的基本原理（2）掌握親和柱的制備方法、蛋白質電泳、免疫親和層析等操作二、實驗儀器與材料三

6、、實驗步驟四、實驗結果五、討論六、體會七、參考文獻Ab