尿道下裂發(fā)病機(jī)制研究

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1、重慶醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文尿道下裂發(fā)病機(jī)制研究姓名：劉星申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：兒科學(xué)（小兒外科學(xué)）指導(dǎo)教師：魏光輝20090501重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文尿道下裂發(fā)病機(jī)制研究摘要背景：尿道下裂(Hypospadias)是d,JL最常見的泌尿生殖道先天畸形。由于陰莖及前尿道發(fā)育不全，尿道開口異常伴陰莖下彎畸形，導(dǎo)致患兒不能站立排尿，并影響成年后性功能及生育力。手術(shù)矯正畸形是本病的唯一治療措施，但術(shù)后并發(fā)癥發(fā)生率較高，是患兒及家長的心患。為此，有關(guān)尿道下裂病因的研究受到學(xué)者們關(guān)注，以期通過尿道下裂病因?qū)W的研究尋找其預(yù)防、治療學(xué)突破。尿道下裂發(fā)

2、病率約1／200～1／300，而且有逐年增加趨勢，大量研究提示其發(fā)病率的增加與環(huán)境雌激素污染密切相關(guān)。鄰苯二甲酸二(2．乙基)己酯(DE唧)是一種廣泛應(yīng)用于塑料及化工產(chǎn)業(yè)的增塑劑，在醫(yī)療工作和日常生活中被大量應(yīng)用，已構(gòu)成我國嚴(yán)重的“白色污染”。DEHP進(jìn)入環(huán)境后不易被降解，能蓄積于人體產(chǎn)生雌激素樣生物活性。課題組前期研究已發(fā)現(xiàn)DEHP可損害實驗動物睪丸及附睪功能導(dǎo)致小鼠隱睪畸形，可同時伴有尿道下裂的產(chǎn)生。雖有文獻(xiàn)報道DEHP能誘發(fā)實驗動物的尿道下裂，但是未就其機(jī)制深入研究。因此，本課題針對DEHP對外生殖器的毒性損傷，研究其致畸機(jī)制，為進(jìn)一步防

3、治尿道下裂發(fā)生提供科學(xué)依據(jù)。目的：利用DEHP的外生殖器的毒性損傷，誘導(dǎo)胎鼠尿道下裂；體內(nèi)外觀察陰莖發(fā)育情況，檢測細(xì)胞凋亡改變、TGF一131及ATF3等在重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文陰莖組織中的表達(dá)；對比尿道下裂患者與正常兒童包皮TGF．131表達(dá)差異，深入探討尿道下裂發(fā)生機(jī)制。方法：1．將C57BL／6及KM孕鼠分為對照組與DEHP處理組，DEHP處理組分為100mg／kg·d、200mg／kg·d與500mg／kg·d三個劑量組(DEHPloo，DEHP200，DEHP500)，于妊娠12．5d-17．5d(GDl2．5～17．5)期間

4、灌胃；對照組于同期用0．1mL玉米油灌胃。于GDl9剖腹取出胎鼠，對比觀察胎鼠陰莖與尿道發(fā)育；尿道橡膠管型重塑胎鼠尿路情況，測量尿道長度；統(tǒng)計尿道下裂發(fā)生率。采用整體原位雜交(MSH)技術(shù)檢測胎鼠陰莖中TGF—plmRNA的表達(dá)。2．獲取上述各組胎鼠及幼年鼠陰莖，運(yùn)用免疫熒光、RT-PCR、westernblot技術(shù)檢測TGF．131與ATF3的表達(dá)；經(jīng)TUNEL染色觀察陰莖內(nèi)細(xì)胞凋亡情況，檢測凋亡相關(guān)蛋白：Bcl．2、Bax及P53的表達(dá)。3．取正常GDl2．5胎鼠陰莖體外培養(yǎng)，分別經(jīng)不同劑量的MEHP、TGF．131細(xì)胞因子及MEHP+TG

5、F．131單克隆抗體干預(yù)，觀察陰莖發(fā)育情況，運(yùn)用RT-PCR對比TGF．131與ATF3基因表達(dá)的變化。4．取尿道下裂病人與正常兒童包皮，采用免疫組化、RT-PCR及熒光實時PCR方法檢測TGF—p1表達(dá)，對比其差異。結(jié)果：1．DEHP成功誘導(dǎo)出尿道下裂小鼠動物模型，尿道下裂表現(xiàn)為陰莖體變短、尿道開口異位、包皮分裂，DEHPloo、DEHP200與DEHP500尿道下裂發(fā)生率分別為7．1％、14．0％和75．7％；實驗組雄性胎鼠體重及肛門尿道口距離(AGD)均值隨DEHP劑量增加而逐漸減小(胙O．05)；尿道橡膠管型顯示尿道下裂胎鼠尿道變短，尤

6、以前尿道明4重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文顯，中高劑量組尿道長度較對照組明顯縮短(肛O．001)；陰莖連續(xù)切片顯示實驗組尿道軸偏向陰莖腹側(cè)，尿道板向腹側(cè)隆起及融合過程落后。WISH檢測發(fā)現(xiàn)胎鼠陰莖中TGF．131mRNA特異表達(dá)于尿道板及尿道上皮。2．RT-PCR、免疫熒光及westernblot均顯示在胎鼠陰莖內(nèi)，TGF．131與ATF3mRNA與蛋白的表達(dá)隨DEHP劑量的增加而逐漸增強(qiáng)，而在生后20d及40d小鼠陰莖內(nèi)，TGF．plmRNA的表達(dá)顯著低于正常對照；陰莖細(xì)胞的凋亡減少伴P53表達(dá)下降，而Bcl．2／Bax比值無明顯變化。3．體

7、外培養(yǎng)條件下胎鼠陰莖能夠較好生長，MEHP及TGF一131細(xì)胞因子能顯著抑制陰莖發(fā)育。MEHP不能上調(diào)TGF．131及ATF3mRNA的表達(dá)，TGF．131細(xì)胞因子也不能上調(diào)ATF3mRNA的表達(dá)，TGF一131抗體不能抑制ATF3mRNA的表達(dá)。4．尿道下裂患兒包皮中TGF．131表達(dá)具有低于正常兒童趨勢。結(jié)論：DEHP誘導(dǎo)胎鼠尿道下裂可能與其上調(diào)TGF．131及ATF3表達(dá)有關(guān)，TGF．131及ATF3的異常表達(dá)可能是尿道下裂發(fā)生機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，但TGF一131可能不與ATF3產(chǎn)生信號傳導(dǎo)。關(guān)鍵詞：尿道下裂，DEHP，MEHP，TGF一13

8、1，ATF3重慶醫(yī)科大學(xué)博士研究生學(xué)位論文STUDYONTHEMECHANISMoFHYPOSPADIASABSTRACTBACKGROUND：Hyp