MMP7基因及蛋白表達(dá)在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用

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1、中國醫(yī)科大學(xué)博士學(xué)位論文MMP-7基因及蛋白表達(dá)在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用姓名：馮眾一申請學(xué)位級別：博士專業(yè)：腫瘤學(xué)指導(dǎo)教師：徐惠綿2003.4.1MMP一7基因及蛋白表達(dá)在胃癌侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用中文摘要目的惡性腫瘤嚴(yán)重威脅人類的健康，腫瘤細(xì)胞向周圍組織器官侵襲和轉(zhuǎn)移是惡性腫瘤最重要的生物學(xué)特性，也是腫瘤病人死亡的主要原因。腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移一直是腫瘤學(xué)研究的熱點(diǎn)和難點(diǎn)問題。腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移是受多基因產(chǎn)物調(diào)節(jié)的多步驟、多階段過程，包括粘附、降解、運(yùn)動(dòng)和血管形成等。其中蛋白水解酶對細(xì)胞外基質(zhì)降解是導(dǎo)致腫瘤轉(zhuǎn)移不可缺少的環(huán)節(jié)。因此，針對蛋白酶在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移中的作用受到國內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。MMP

2、一7(matrilysin)是基質(zhì)溶解素的一種，基質(zhì)金屬蛋白酶家族中分子量最小的成員，不僅具有其它MMPs所具有的高度蛋白溶解能力及廣泛的底物特異性，并在腫瘤血管形成中發(fā)揮重要作用。同時(shí)與其它基質(zhì)金屬蛋白酶不同的是MMP一7主要為上皮源性腫瘤細(xì)胞高表達(dá)，基質(zhì)不表達(dá)。MMP一7這種上皮源性腫瘤細(xì)胞增高表達(dá)的相對特異性有助于研究其在腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用，并可能成為判斷腫瘤細(xì)胞惡性生物學(xué)行為的一個(gè)指標(biāo)。目前關(guān)于MMPL7在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用的研究國外較多，國內(nèi)很少。研究主要限于胃癌原發(fā)灶與浸瀾深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移及腹膜轉(zhuǎn)移的關(guān)系。腹水MMP一7基因表達(dá)在腹膜轉(zhuǎn)移中的直接作用的研究尚未見報(bào)道

3、。本實(shí)驗(yàn)通過檢測胃癌組織及腹腔沖洗液MMP--7基因及蛋白表達(dá)，研究其與胃癌浸潤深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的關(guān)系及在腹膜轉(zhuǎn)移中的作用，為臨床應(yīng)用蛋白酶抑制劑防治淋巴結(jié)及腹膜轉(zhuǎn)移提供理論依據(jù)和治療靶點(diǎn)。方法腹水或腹腔沖洗液標(biāo)本收集：術(shù)中開腹后即刻于Douglas腔或右肝下置入一根16號導(dǎo)尿管，注入無菌生理鹽水100毫升，輕輕攪動(dòng)后抽出60毫升。若有自然腹水則直接抽取。取腹水時(shí)盡可能避免出血，防止腹水中混入血液成分。抽取的腹水或沖洗液分成兩等分在低溫離心機(jī)中2000轉(zhuǎn)／分，離心15分鐘。一部分上清液置于一70。C冰箱中凍存，沉渣涂片HE染色查瘤細(xì)胞；另一部分取沉渣立即加入1毫升阿肋l液進(jìn)行總RNA

4、提取及反轉(zhuǎn)錄，將eDNA置-700C冰箱中凍存，以備PCR擴(kuò)增。lit—PCR擴(kuò)增：1)總RNA提?。?)逆轉(zhuǎn)錄合成MMP一7eDNA；3)PCR擴(kuò)增MMP一7；4)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的檢測與半定量。其中Trizol一步法總RNA提取。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠電泳銀染。自動(dòng)圖象分析系統(tǒng)分別對目的基因MMP一7及內(nèi)對照GAPDH的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶進(jìn)行分析，通過MMP一7指數(shù)對MMP一7mRNA進(jìn)行半定量。MMP一7指數(shù)=MMP一7值／GAPDH值，MMP-7指數(shù)與其mRNA含量呈正變關(guān)系。免疫組化染色：采用S—P法。微波修復(fù)處理。PBS代替一抗作空白對照，已知表達(dá)MMP一7乳腺癌切片作

5、陽性對照。用正常兔血清代替一抗作陰性對照，參照S—P試劑盒說明書進(jìn)行免疫組化染色。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：最后應(yīng)用x2檢驗(yàn)對免疫組化結(jié)果及t檢驗(yàn)對RT—PCR結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果胃癌組織MMP一7基因及蛋白表達(dá)：MMP一7蛋白幾乎均為胃癌細(xì)胞胞漿或胞膜表達(dá)，陽性率為,16．6％，基質(zhì)不表達(dá)，偶有正常胃粘膜上皮細(xì)胞極弱表達(dá)。浸潤深度透漿膜者M(jìn)MP一7基因及蛋白表達(dá)顯著高于未透漿膜者(P<0．05)；MMP一7基因表達(dá)與TNM分期無關(guān)；Ⅲ／Ⅳ期胃癌MMP一7蛋白表達(dá)顯著高于I／Ⅱ期胃癌(p

6、5)；MMP一7基因及蛋白表達(dá)與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者M(jìn)MP一7基因及蛋白表達(dá)顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性者(P<0．05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移距離Ⅱ站及以上者顯著高于Ⅱ站以下者(P<0．05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度>50％者顯著高于淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度<50％者(P<0．05)；MMP一7基因表達(dá)與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目無關(guān)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目>5個(gè)者M(jìn)MP-7蛋白表達(dá)顯著高于<5個(gè)者(P<0．05)?！?·腹腔沖洗液MMP一7基因表達(dá)：腹水MMP一7基因表達(dá)與浸潤深度及TNM分期無明顯關(guān)系。但浸潤深度透漿膜及Ⅲ／Ⅳ期胃癌病人腹水MMP一7基因表達(dá)仍高于未透漿膜及I／Ⅱ期者。腹水MMP一7基因表達(dá)與淋巴結(jié)

7、轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陽性者顯著高于陰性者(P<0．01)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移數(shù)目>5個(gè)者顯著高于<5個(gè)者(P<0．05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移距離Ⅱ站及以上者顯著高于Ⅱ站以下者(P<0．05)；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移度>50％者顯著高于<50％者(P