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1、正交設(shè)計(jì)法優(yōu)化川木通RAPD-PCR體系研究作者：國錦琳，陳璐，任艷，裴瑾，萬德光【摘要】目的確定川木通RAPD-PCR反應(yīng)各因素的最佳水平，最終確定RAPD-PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件。方法采用正交設(shè)計(jì)L16（45）在4個(gè)水平上對(duì)川木通類植物進(jìn)行RAPD-PCR進(jìn)行試驗(yàn)。兩次結(jié)果分別用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB進(jìn)行分析。結(jié)果最終確定RAPD-PCR反應(yīng)的最佳反應(yīng)條件為：20μl體系，其中含1×PCRbuffer,2.5mmol/LMgCl2,0.15mmol/LdNTPs,1.0UTaq酶，0.5μm
2、ol/L10-mer引物，50ng模板DNA，最終確定退火溫度36℃。同時(shí)發(fā)現(xiàn)Taq酶對(duì)反應(yīng)體系影響最大。結(jié)論建立了可靠的反應(yīng)體系，為該類藥材的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)?！娟P(guān)鍵詞】正交設(shè)計(jì)；川木通；RAPD-PCR7川木通類藥材均來自于毛茛科鐵線鏈屬植物，該屬植物我國共分布有108個(gè)種［1］，有些鐵線蓮屬藥用植物外形極為相似，有時(shí)非花期植株難以鑒別，經(jīng)過藥材加工后更加難以辨別，容易在應(yīng)用中造成品種混亂，影響臨床用藥安全與療效。因此，在具體開發(fā)使用本屬藥用植物資源時(shí)，應(yīng)重視和加強(qiáng)對(duì)其品種的鑒定，以確保資源
3、的正確合理使用。RAPD繼承了PCR技術(shù)效率高，樣品用量少（只需少量DNA樣品），靈敏度高，檢測容易等優(yōu)點(diǎn)［2］，目前被廣泛地應(yīng)用于藥用植物的分類鑒定工作。但PCR各因素水平對(duì)反應(yīng)結(jié)果均有影響。目前關(guān)于川木通RAPD-PCR的反應(yīng)體系優(yōu)化未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)采用正交設(shè)計(jì)L16(45)在4個(gè)水平上對(duì)川木通類植物進(jìn)行RAPD-PCR進(jìn)行試驗(yàn)，建立了較為可靠的反應(yīng)體系。本工作為以后該類植物與藥材的分子鑒定奠定了基礎(chǔ)?！ ?材料本實(shí)驗(yàn)所使用的川木通原植物均為作者在四川各地實(shí)地采集，植物葉片采集后采用硅膠直接干
4、燥，另外部分采集后直接編號(hào)用液氮保存，此后保存在-80℃冰箱備用，所采集植物均經(jīng)過萬德光教授鑒定后備用。 Taq聚合酶、dNTP、T4連接酶、瓊脂糖購自TaKaRa寶生物工程（大連）有限公司；RAPD引物購自北京賽百盛公司。 2方法 2.1植物總DNA的小規(guī)模提取與DNA濃度的測定提取方法按干滟等［3］的方法并稍加改進(jìn)。測定濃度后稀釋至50ng/μl。 2.27PCR反應(yīng)因素水平的確定與正交表的設(shè)計(jì)［4］為了確定PCR反應(yīng)中的5個(gè)因素（Taq酶、Mg2+、模板DNA、dNTP、引物）的最佳
5、水平，采用正交設(shè)計(jì)L16(45)在4個(gè)水平上進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。參加PCR反應(yīng)的因素水平見表1，L16(45)設(shè)計(jì)方案見表2。表1PCR反應(yīng)的因素水平μl水平（略）表2PCR反應(yīng)的因素水平L16(45)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)μl（略） 將表2的16個(gè)處理重復(fù)兩次，在PCR儀上進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果電泳檢測，記錄。用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB進(jìn)行分析，得到川木通RAPD-PCR反應(yīng)各因素的最佳水平，最后在PCR儀上，用此最佳因素水平的PCR反應(yīng)體系進(jìn)行梯度退火試驗(yàn)，篩選得到最佳退火溫度。 2.3RAPD擴(kuò)增在正交結(jié)果的基礎(chǔ)上，
6、建立了本實(shí)驗(yàn)所使用的體系［5，6］。RAPD擴(kuò)增反應(yīng)所采用的條件和體系如下：20μl體系，其中含1×PCRbuffer，2.5mmol/LMgCl2，0.15mmol/LdNTPs，1.0UTaq酶，0.5μmol/L10-mer引物，50ng模板DNA，補(bǔ)ddH2O至終體積20μl。PCR反應(yīng)熱循環(huán)程序如下：95℃預(yù)變性5min；36℃復(fù)性1min；72℃延伸1.5min；94℃變性1min；36℃復(fù)性1min；72℃延伸1.5min，35個(gè)循環(huán)。最后72℃延伸10min，反應(yīng)產(chǎn)物在4℃保存?！?/p>
7、 2.4電泳分析與結(jié)果統(tǒng)計(jì)DNA擴(kuò)增產(chǎn)物在1×TAE的緩沖條件下，于1.5%瓊脂糖凝膠分離，溴化乙錠染色。標(biāo)準(zhǔn)分子量為Tokara提供的DL20007Marker。使用凝膠成像系統(tǒng)（GDS8000，美國UVP）拍照分析。 3結(jié)果 3.1電泳結(jié)果評(píng)分按照表2設(shè)計(jì)的16個(gè)處理進(jìn)行PCR反應(yīng)后，產(chǎn)物進(jìn)行電泳。結(jié)果見圖1?！ 「鶕?jù)電泳結(jié)果，按照本實(shí)驗(yàn)?zāi)康?，即以后將要進(jìn)行的遺傳多樣性分析的要求將16個(gè)處理從高到低依次打分，條帶數(shù)量越豐富、清晰度越高、背景低的最佳產(chǎn)物記為16分，與此相反，最差的記為1分［
8、7,8］。兩次重復(fù)分別獨(dú)立設(shè)計(jì)，從兩次重復(fù)的結(jié)果看，各個(gè)處理組合的反應(yīng)都具有較高的一致性。兩次記分分別為1，13，14，11，10，16，15，12，2，9，8，7，6，5，4，3和1，12，14，13，10，16，11，15，2，8，9，7，5，6，4，3?！ ?.2各因素對(duì)PCR反應(yīng)影響的差異分析將上述處理結(jié)果用統(tǒng)計(jì)軟件MINITAB(MinitabInc.)進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表3。由F值可見，Taq酶的影響最大，模板的影響最小，各因素對(duì)PCR反應(yīng)的影響由大到小依次為：Taq
