青蒿琥酯對肝癌HEPG2細胞Caspase3和P53蛋白的影響實驗研究

《青蒿琥酯對肝癌HEPG2細胞Caspase3和P53蛋白的影響實驗研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內(nèi)容在學術論文-天天文庫。

1、青蒿琥酯對肝癌HEPG-2細胞Caspase-3和P53蛋白的影響實驗研究作者：陳永順，李靜，楊斌，陳氏紅【摘要】目的研究青蒿琥酯(artesunate,Art)對腫瘤細胞增殖的影響和機制。方法MTT法測定青蒿琥酯對HEPG-2細胞增殖的影響，ELISA方法研究Caspase-3的活性，DNA電泳觀察細胞DNA的變化，免疫組化研究凋亡相關蛋白p53,bcl-2,bax的表達。結果青蒿琥酯作用細胞48h后可明顯誘導HEPG-2細胞凋亡，并影響Caspase-3,p53,bcl-2蛋白的表達。結論青蒿琥酯可明顯抑制HEPG-2細胞的增殖，促進HEPG-2細胞的凋亡，其機制可能是通過激活Caspas

2、e-3的活性，以及調(diào)節(jié)p53，bcl-2蛋白的表達而實現(xiàn)的?！娟P鍵詞】青蒿琥酯;Casepase-3;P53　青蒿琥酯(Art)作為一種含內(nèi)過氧化基團的倍半萜內(nèi)酯化合物，主要用于瘧疾治療。近年研究發(fā)現(xiàn)，其還具有抗腫瘤作用[1]。本實驗以人肝癌HEPG-2細胞株為作用對象，研究青蒿琥酯對腫瘤細胞株相關基因和蛋白的影響?！　?儀器與材料6　　1.1儀器全自動CO2孵箱(美國ThermoFormo)，倒置顯微鏡(日產(chǎn))，雷勃MK3酶標儀，貝克曼熒光顯微鏡，凝膠成像分析系統(tǒng)(美國Bio-Rad)，DMR+Q550病理圖象分析系統(tǒng)(萊卡公司)。　　1.2試劑四唑鹽(MTT)，二甲基亞砜(DMSO)均購自

3、Sigma公司,青蒿琥酯購于桂林南藥股份公司(批號060109);紫杉醇，上海華聯(lián)制藥廠生產(chǎn)，購于廣西醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院藥劑科(批號060202)，Caspase-3檢測試劑盒(碧云天生物技術研究所)，Annvie-FITC試劑盒(晶美生物公司)，P53-抗，bcl-2-抗,bax-抗(北京中杉生物技術開發(fā)有限公司)，細胞凋亡DNA提取試劑盒(碧云天生物技術研究所)，DNAladder(廣州東盛生物技術開發(fā)有限公司)?！　?.3細胞株和細胞培養(yǎng)人肝癌HEPG-2細胞株從廣西醫(yī)科大學實驗中心病理科細胞室引進，培養(yǎng)在含10%小牛血清，含青、鏈霉素各100u/ml的RPMI-1640培養(yǎng)液中，37

4、℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，0.25%胰蛋白酶消化傳代?！　?方法　　2.1MTT法檢測細胞的增殖活性采用MTT法，取對數(shù)生長期的HEPG-2細胞，按每孔細胞3×103～5×103個，190μl接種于96孔培養(yǎng)板中，每組設6個復孔，126h貼壁后加入各組藥物，藥物終濃度梯度為200，100，50μg/ml，37℃、5%CO2飽和濕度下培養(yǎng)24，48，72h，OD值測量波長為雙波長570nm/630nm。以下列公式計算抑制率：抑制率=(1-加藥組OD/對照組OD)×100%，實驗重復3次?！　?.2Caspase-3活性的研究經(jīng)過預處理后的細胞，每2×106個細胞的比例加100μl裂解液，

5、冰浴15min，4℃,16000g，離心15min，收集上清，采用Caspase-3ELISA試劑盒，按說明書操作。由PNA不同濃度對應的OD值得出標準曲線，由樣品空中OD值，根據(jù)標準曲線方程求得相應樣品空中Caspase-3活性濃度?！　?.3DNALADDER的觀察收集Art處理48h后的細胞，按照試劑盒說明書，提取細胞DNA，進行1.2%瓊脂糖凝膠電泳，凝膠成像分析系統(tǒng)下拍照?！　?.4p53,bcl-2,bax等蛋白的研究免疫細胞化學法檢測p53，bcl和bax的表達，按試劑盒說明依次操作，用PBS代替一抗作為陰性對照?！　?結果　　3.1IC50的測定每個濃度梯度的抑制率得出后，采用

6、Bliss法求得Art作用HEPG-2細胞的24，48，72h的IC50分別為(103.1±68.6)，(75.3±4.1)，(65.7±6.0)μg/ml[2]?！　?.2caspase-3活性的改變測得OD值后，根據(jù)OD值由擬合的標準曲線求得相應樣品空中活性Caspase-3的濃度(48h)。與空白組比較，藥物作用后細胞中Caspase-3濃度高于對照組(P<0.01)?！　?.3DNAladder的觀察細胞凋亡最主要的生化標志是內(nèi)源性鈣一鎂離子依賴性核酸內(nèi)切酶被激活，選擇性降解染色體核小體間DNA，從而在瓊脂糖凝膠電泳上可能呈現(xiàn)規(guī)則的、間隔180～200bp的“DNA梯子”樣條帶。

7、由圖1可見，Art處理HEPG-2細胞48h后，進行瓊脂糖凝膠電泳，隨著藥物濃度的加大，“DNA梯子”樣條帶逐漸清晰，呈一定的劑量依賴性?！　”?Art作用后caspase-3的濃度　圖1Art處理后的電泳圖　　3.4免疫組化結果細胞染色評分參考薛宏偉等的方法[3]。本實驗對HEPG-2肝癌細胞株的凋亡相關基因產(chǎn)物p53、bcl-2、bax蛋白進行了研究，結果發(fā)現(xiàn)，用青蒿琥酯(100μg/ml)處