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《小鼠肝細胞AMPK相關microRNAs的篩選及功能研究》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關內容在學術論文-天天文庫。
1、分類號：R587．1密級：學位類別：科學學位口專業(yè)學位囤冒學校代碼：10062學號：2010601099學科門類：醫(yī)學又坪眚科袁號博士學位論文DoCToRALDISSERTATIoN論文題目：小鼠肝細胞AMPK相關microRNAs的篩選及功能研究TITLEAMPK-relatedmicroRNAsexpressionprofileinmousehepatocytesandfunctionresearch一級學科：臨床醫(yī)學二級學科：內科學內分泌與代謝病論文作者：劉佳指導教師：張宏教授導師組成員：邸阜生主任醫(yī)師李紅濤主任醫(yī)師天津醫(yī)科大學研究生院
2、二。一三年五月學位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是我個人在導師指導下獨立進行研究工作取得的研究成果。除了文中特別加以標注引用的內容和致謝的地方外，論文中不包含任何其他個人或集體已經發(fā)表或撰寫過的研究成果，與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示了謝意。學位論文作者簽名：學位論文版權使用授權書日期p哆年，肛日本學位論文作者完全了解天津醫(yī)科大學有關保留、使用學位論文的規(guī)定，即：學校有權將學位論文的全部或部分內容編入有關數據庫進行檢索，并采用影印、縮印或掃描等復制手段保存、匯編以供查閱和借閱。同意學校向國家
3、有關部門或機構送交論文，并編入有關數據庫。保密口，在——年解密后適用本授權書。本論文屬于不保密函。(請在相對應的方框內打“√”)學位論文作者簽名：導師簽名：Et期：為／弓年廠月M日日期：勵；釘鋤日天津醫(yī)科大學博士學位論文中文摘要目的：腺苷酸活化蛋白激酶(adenosinemonophosphate—activatedproteinkinase，AMPK)是細胞適應環(huán)境和營養(yǎng)變化的核心，肝臟是碳水化合物儲存和釋放最重要的器官。microRNAs(miRNAs)是一組新發(fā)現的小分子RNA，幾乎可以作用于機體包括能量代謝的各個重要的生命過程。本研究
4、擬篩選小鼠肝細胞中參與AMPK信號傳導途徑的miRNAs，通過生物信息學方法尋找可能參與AMPK對能量代謝有調控作用的miRNAs，預測其靶基因及可能的生物學功能，并進一步驗證其在AMPK調節(jié)肝糖代謝中發(fā)揮的作用。方法：1．肝細胞AMPK相關miRNAs的篩選：雄性C57BL／6小鼠原代肝細胞體外培養(yǎng)，雙丁酰環(huán)腺苷酸(dibutyryl—cyclicadenosinemonophosphate，Btz·cAMP)干預作為Bt2一cAMP組，實驗組再加入不同濃度(O．125mM、0．25raM、0．5mM、lmM)的5．氨基咪唑．4．甲酰胺．1
5、-B．D．呋哺核糖苷(5-aminoimidazole．4．carboxamide．1．B．d．ribofuranoside，AICAR)干預，westernblotting方法檢測AMPK、環(huán)腺苷一磷酸反應元件結合蛋白調節(jié)轉錄共激活子2(cyclicadenosinemonophosphate-responseelementbindingprotein-regulatedtranscriptioncoactivator2，CRTC2)蛋白及其磷酸化水平的表達，PCR方法檢測過氧化物酶體增殖物激活受體7共激活因子la(peroxisomepr
6、oliferator-activatedreceptor-1，coaetivator-10t，PGC—la)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvatecarboxykinase，PEPCK)和葡萄糖．6．磷酸酶(glucose．6-phosphase，G6pase)基因的表達；選擇合適的AICAR濃度，Bt2．cAMP組為對照組進行miRNAs芯片檢測兩組細胞miRNAs譜的差異。2．AMPK相關miRNAs的生物信息學分析：Targetscan網站對芯片結果中變化超過2倍的miRNAs分成上調和下調的兩組分別進行靶基因
7、預測，FunDo分析靶基因與疾病的關系。選擇在肝臟中表達豐富、AICAR干預后變化顯著的miRNA，應用多個靶基因預測網站再次進行靶基因預測，推測其在AMPK對肝糖代謝的調節(jié)過程中可能發(fā)揮的作用。3．miR-29參與AMPK信號途徑對肝糖異生的調節(jié)：realtimePCR方法檢測AICAR干預后miR．29家族、靶基因p85a和糖異生相關基因PEPCK、G6pase天津醫(yī)科大學博士學位論文的表達；設計構建miR-29家族模擬物，轉染小鼠原代肝細胞，轉染成功后，PCR方法檢測p85tx和PEPCK、G6pase基因的表達，westernblot
8、ting方法檢測p85a蛋白的表達；進一步在禁食14h小鼠及正常進食的對照小鼠肝臟中檢測miR．29家族、p85et基因和蛋白的表達，觀察不同狀態(tài)下AMPK對miR
