SSR分子標(biāo)記在甘蔗遺傳育種中的研究現(xiàn)狀

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1、SSR標(biāo)記在作物遺傳育種中的應(yīng)用藍(lán)松濤2012301120022主要內(nèi)容1、SSR標(biāo)記技術(shù)的原理和特點(diǎn)2、SSR標(biāo)記技術(shù)的技術(shù)要點(diǎn)3、SSR標(biāo)記技術(shù)在育種中的應(yīng)用4、SSR標(biāo)記技術(shù)未來發(fā)展分子標(biāo)記背景分子標(biāo)記是繼形態(tài)標(biāo)記、細(xì)胞標(biāo)記和生化標(biāo)記之后發(fā)展起來的一種較為理想的遺傳標(biāo)記形式，它以蛋白質(zhì)、核酸分子的突變?yōu)榛A(chǔ)，檢測(cè)生物遺傳結(jié)構(gòu)及其變異。目前廣泛應(yīng)用的DNA分子標(biāo)記有三代，分別為第一代的限制性片段長度多態(tài)性(RFLP)，隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA(RAPD)，第二代的擴(kuò)增酶切片段長度多態(tài)性(AFLP)，簡單序列重復(fù)長度多態(tài)性(SSR)，第三代的單核苷酸多

2、態(tài)性(SNP)等。由于SSR標(biāo)記具有共顯性、技術(shù)簡單、多態(tài)性豐富等特點(diǎn)，使得SSR標(biāo)記在分析遺傳多樣性和構(gòu)建品質(zhì)指紋圖譜與品種鑒定方面有著極高的效率，因而ssr被廣泛運(yùn)用于農(nóng)業(yè)育種等方面。SSR的概念SSR(Simplesequencrepeat)標(biāo)記即簡單序列重復(fù)。具體一點(diǎn)就是簡單的核苷酸序列的重復(fù)。在DNA中主要以2～5個(gè)核苷酸為重復(fù)單位，如(GA)n、(AC)n、(GAA)n等，這個(gè)n一般為10-50.由于重復(fù)次數(shù)n的不同，SSR序列就有不同的長度，這就構(gòu)成了它的多態(tài)性。因此SSR序列非常適合區(qū)分各種有親緣關(guān)系的物種基因型。SSR序列廣泛分布在

3、幾乎所有真核細(xì)胞生物及少數(shù)原核細(xì)胞生物的基因組中，SSR序列的分布是隨機(jī)的，大約每隔10000-50000個(gè)堿基對(duì)，就有1個(gè)SSR序列。SSR標(biāo)記技術(shù)的原理同一類SSR可分布在基因組的不同位置上。由于SSR中的重復(fù)單位數(shù)目是高度變異的，且SSR兩端的序列一般是相對(duì)保守的單拷貝序列，因而根據(jù)其兩端的序列可設(shè)計(jì)一對(duì)互補(bǔ)序列的寡聚核苷酸引物，通過PCR擴(kuò)增產(chǎn)生重復(fù)序列長度多態(tài)性。GAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAABCABCSSR標(biāo)記技術(shù)的特點(diǎn)與其他分子標(biāo)記（AFLP、RAPD、RFLP等）相比，SSR標(biāo)記具有

4、以下優(yōu)點(diǎn)：①多態(tài)性高。②具有多等位基因的特性，其PCR產(chǎn)物在進(jìn)行測(cè)序膠電泳分離時(shí)具有單堿基高分辨率，遺傳信息量大。③每個(gè)位點(diǎn)由設(shè)計(jì)的引物順序決定，便于合作交流開發(fā)引物。④由于SSR多態(tài)性僅由簡單序列的重復(fù)次數(shù)的差異起，通常為共顯性標(biāo)記，呈孟德爾方式遺傳，具有很好的穩(wěn)定性，因而對(duì)個(gè)體鑒定具有特殊意義。⑤僅需微量組織，DNA用量少，即使DNA降解也能有效地分析鑒定。⑥技術(shù)要求低，易于實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化。然而SSR標(biāo)記技術(shù)也有其缺陷：主要在于SSR座位突變率高，對(duì)變異反應(yīng)非常敏感，所以易受到趨同變異引起的平行演化程度的影響，從而給物種間親緣關(guān)系的評(píng)估帶來誤差。同時(shí)

5、SSR是必須針對(duì)每個(gè)染色體座位測(cè)定并找到SSR兩端寡聚核苷酸來設(shè)計(jì)引物，較費(fèi)時(shí)耗力。SSR標(biāo)記技術(shù)的技術(shù)要點(diǎn)SSR標(biāo)記技術(shù)的核心技術(shù)是引物的設(shè)計(jì)、PCR擴(kuò)增、凝膠電泳分析。目前，被用于SSR標(biāo)記引物設(shè)計(jì)的方法主要有文庫法、富集法、近緣物種間共用引物法、生物信息學(xué)法等。文庫法是經(jīng)典的SSR引物設(shè)計(jì)方法，其過程為：首先建一個(gè)基因組文庫提取基因組DNA限制性內(nèi)切酶或超聲波處理獲得DNA片段將DNA片段接入噬菌體或質(zhì)粒中用放射性同位素或地高辛標(biāo)記的含有SSR序列的寡聚核苷酸探針篩選文庫對(duì)篩選出的陽性克隆測(cè)序選擇序列較長且SSR序列位點(diǎn)偏向序列中部的SSR序列

6、兩端的側(cè)翼序列設(shè)計(jì)引物（一般為20～25個(gè)堿基對(duì)）。引物的設(shè)計(jì)富集法是由文庫法改進(jìn)而來的。首先建一個(gè)小插入片段基因組文庫，再使用含重復(fù)序列的寡核苷酸引物或探針對(duì)該基因組文庫進(jìn)行富集篩選，使用篩選出的陽性克隆構(gòu)建一個(gè)富集文庫。而后的基因文庫篩選、陽性克隆測(cè)序和引物設(shè)計(jì)過程與文庫法的一致。近緣物種間共用引物法是指研究者可以使用與目標(biāo)物種具有較近親緣關(guān)系的其他物種（同科不同屬或同屬）的SSR序列引物來設(shè)計(jì)SSR標(biāo)記引物或直接進(jìn)行SSR分子標(biāo)記的方法。生物信息學(xué)法是指研究者使用SSR序列搜索軟件在基因組數(shù)據(jù)庫或報(bào)道文獻(xiàn)中搜索相關(guān)的基因序列和表達(dá)序列標(biāo)簽（ES

7、T）序列，從而獲得SSR序列信息來設(shè)計(jì)所需的引物。PCR擴(kuò)增SSR擴(kuò)增雖然重復(fù)性和穩(wěn)定性相對(duì)較好，但對(duì)于不同的引物對(duì)，其G+C的含量不同和擴(kuò)增片段長度不同，不同物種的DNA擴(kuò)增條件存在差異，其退火溫度就要做適時(shí)的調(diào)整，同時(shí)也要通過對(duì)藥品體系濃度、熱循環(huán)程序次數(shù)等反應(yīng)參數(shù)的調(diào)整來獲得清晰可靠、方便統(tǒng)計(jì)分析的條帶。增產(chǎn)物的分離和檢測(cè)SSR標(biāo)記技術(shù)在育種中的應(yīng)用遺傳連鎖圖譜構(gòu)建2分子標(biāo)記輔助育種4親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究31DNA指紋和品種鑒定33親緣關(guān)系和遺傳多樣性的研究由于SSR標(biāo)記技術(shù)具有實(shí)驗(yàn)結(jié)果重復(fù)性好和等位基因多態(tài)性豐富的特點(diǎn)，因此該方法非常適

8、合對(duì)農(nóng)作物品種資源的遺傳多樣性進(jìn)行分析。通過確定農(nóng)作物品種資源間的遺傳距離，建立遺傳關(guān)系譜系，育種者可以進(jìn)行