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《里氏木霉RUT-C30β-甘露聚糖酶的誘導表達及其cDNA的克隆》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學碩士學位論文里氏木霉RUT—C30β—甘露聚糖酶的誘導表達及其cDNA的克隆姓名：高宏斌申請學位級別：碩士專業(yè)：基礎(chǔ)獸醫(yī)學指導教師：王和平2003.5.1摘要在里氏木霉RutC一30的基礎(chǔ)培養(yǎng)基(Mandels營養(yǎng)液)中加入固定碳源乳糖和槐豆膠，然后將可變碳源(云杉纖維、玉米芯纖維、麥桿纖維、麥桿木聚糖、玉米芯木聚糖、云杉甘露聚糖)進行單因子、雙因子、三因子、四因子、五因子的里氏木霉RutC一30正交培養(yǎng)實驗，并以槐豆膠為底物用3，5二硝基水楊酸法測定培養(yǎng)液中B一甘露聚糖酶的活力。從而確定
2、了酶活最高且菌體生長良好的含云杉纖維、麥桿木聚糖和云杉甘露聚糖的誘導培養(yǎng)基為最佳培養(yǎng)基，用該培養(yǎng)基培養(yǎng)的里氏木霉(■reesei)RutC．30使其轉(zhuǎn)錄的B一甘露聚糖酶(B—l，4-mannanmannohydrolaseEC3．2．1．78)mRNA量能夠滿足RT—PCR的要求。分取誘導培養(yǎng)液中的菌體，用異硫氰酸胍法提取總RNA，總RNA再經(jīng)無RNA酶的DNA酶處理后用于RT—PCR。在PCR擴增目的基因時，通過優(yōu)選擴增體系，使鎂離子濃度為】．25rr山l時RT—PCR可順利地獲得目的基因，并能定向克
3、隆到載體pGEM一3Z(amp7)中。用克隆載體轉(zhuǎn)化宿主大腸桿菌JMl09，通過篩選獲取陽性克隆子，對陽性克隆子進行酶切與PCR鑒定，并對載體中插入的目的基因進行測序。其測序結(jié)果與genbank中的里氏木霉RutC．30B一甘露聚糖酶成熟肽eDNA序列進行序列同源性比較，結(jié)果二者序列完全一致。關(guān)鍵詞：罩氏木霉RutC．30、B一甘露聚糖酶、cPNA克隆TheInducementExpressionoftheB—1TlannanasefromTrichodermareeseiRUT-C30andeDNAC
4、loningof[3--mannanaseAhstractTllisexperimentpassingtogropeforthecarbonsourceconstitutesoftheculturemediumandusingZReeseiRutC-30inducedtheexpressionofB—I'ilanllml3asefB一1,4-MannanmarmohydrotaseEC3．2．1．78)．InthisexperinlenlIputtheconstantcarbonsource(1acto
5、seandlocustbeangum)inthefoundationculturemedium0vlandelsnourishmentliquid)ofZReeseiRutC-30，thenproceededthevariablecarbonsource(&agonsprucefiber,cornrushpithfiber,wheatst／'awfiber,wheatstrawxylan,C01TIrushpithxylan,dragonsprucemaunan)tosinglefactor,doubl
6、efactor,threefactor,fourfactorandfivefactororthogonalexperkment．Ideterminedtheactivi乜,ofB-iTlaDDanaseusinglocostbeangumassubstractbythe3，5-dinitosalicyfieacidmethod,andobservedthegrowingsituationofthegerm。AttheendIselectedthedirectionsf-ort}1einducemente
7、xpressionoft11eB—mannana3efromTrichOdermareeseiRut·C30thatcontainedthedragonsp／xlcefiber,wheatstrawxylan，dragonsprucemallAlan．111etotalRNAwaspurifiedfromthegermintheliquidbytheguanidineisothiocyamehodmethod,thenthetotalRNAdigestedbyDNasethathadnotRNasewa
8、susedforRT—PCR．IchangethemagnesiumiondencityinthePCRsysteminordertooptimizethePCRcondition．AttheendIselectedthemagnesiumiondensityas1．25mM．n拉productionofRT-PCRwasinserteddirecfionaUyintopGEM--3Z(amp‘)．nle!N3EM--3Z(鯽lpT)was
